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高病原性家禽流行性感冒實驗室診斷標準作業程序（以下簡稱本標準）所制訂之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行高病原性家禽流行性感冒病毒分離鑑定及血清學試驗操作時參考之程序。 |
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| 1. |
高病原性家禽流行性感冒： |
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高病原性家禽流行性感冒（Highly pathogenic avian influenza, HPAI）係由正黏液病毒科（Orthomyxoviridae）之流行性感冒A型病毒感染所引起，依年齡禽別及環境因素之差異，高病原性毒株引起之臨床症狀也有極大差異，有些無任何明顯症狀即急速斃死、有些則會呈現特徵性呼吸症狀、過度流淚、鼻竇炎、頭部水腫、發紺下痢等變化。造成雞及火雞急性臨床疾病之高病原性流行性感冒A型病毒屬H5、H7亞型，不過很多從鳥類分離之H5、H7亞型病毒卻屬於低病原性。 |
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| 2. |
流行性感冒A型病毒： |
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流行性感冒A型病毒，是正黏液病毒中唯一感染鳥類之病毒，許多種鳥類對本病毒具感受性，所幸大多數的分離株對雞及火雞皆屬低病原者，流行性感冒A型病毒間具有抗原性相關的核蛋白衣（nucleocapsid）及基質多胜呔（matrix polypeptides）並以病毒之紅血球凝集素（hemagglutinin, H）及神經胺酸 （neuraminidase, N）抗原區分亞型。目前，一共有15個H亞型（H1-H15）及9個N亞型（N1-N9）。 |
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| 3. |
血球凝集性： |
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家禽流行性感冒病毒表面HA抗原會與數種動物之紅血球發生凝集作用。 |
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| 4. |
血球凝集抑制(HI)試驗： |
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利用病毒與血球產生凝集作用之特性來進行抗體檢測之方法。 |
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| 5. |
RDE (Receptor destroying enzyme) 處理： |
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當血清中有偽血球凝集接受體，會造成血清檢測有非特異性抑制血球凝集力價出現，需以RDE處理。 |
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| 6. |
神經氨酸分析 (NA) ： |
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家禽流行性感冒病毒表面NA抗元之活性試驗。 |
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| 7. |
靜脈內接種病原性指數（ IVPI ）： |
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檢測AIV對雞的病原性，藉接種後發病或死亡觀察分數 |
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家禽流行性感冒病毒的血清亞型眾多，呈現的病原性也不一定，因此高病原性家禽流行性感冒的之診斷需靠病毒分離及對適當宿主進行病原性之鑑定來做最後確診。
| 1. |
材料與設備：
| (1) |
恆溫箱（34~37°C） |
| (2) |
滾動式培養箱 |
| (3) |
pipette（1.0ml、5ml、10ml） |
| (4) |
照蛋器 |
| (5) |
雞蛋打孔器 |
| (6) |
鐵胃 |
| (7) |
離心機（1000-3500rpm、SS34 離心軸(Rotor)Sorval RC5高速離心機，離心30,000 g） |
| (8) |
冰箱（一般4℃冰箱） |
| (9) |
超低溫冰櫃(-70~-100℃) |
| (10) |
9~11日齡SPF雞蛋胚胎（農委會家畜衛生試驗所生產） |
| (11) |
無菌注射針筒（1.c.c、2.5 c.c、5 c.c、10c.c） |
| (12) |
石臘或指甲油 |
| (13) |
酒精(70%、95%) |
| (14) |
試管(10-15ml) |
| (15) |
病毒保存瓶(2ml) |
| (16) |
碘酒棉花 |
| (17) |
14cm手術剪刀 |
| (18) |
穿透式電子顯微鏡(HITACH) |
| (19) |
暗室 |
| (20) |
HA試驗用96孔U底微量盤 |
| (21) |
無菌袋 |
| (22) |
電顯用Grid |
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| 2. |
試劑：
| (1) |
乳劑用PBS（pH7.0~7.4）：PBS中添加penicillin （2,000u/ml），streptomycin （2mg/ml），gentamycin （50μg/ml） 及mycostatin （1,000u/ml） 最後調整pH7.0~7.4 |
| (2) |
運輸保存液：腦心浸出液(BHI broth)或Nutrient broth(NB)或MEM 含1﹪Bovine serum albumine以上添加抗生素Penicillin 10,000IU/ml, Streptomycin 10,000μg/ml, Amphotericin B 5μg/ml |
| (3) |
1%血球懸浮液：製備方法參HA試驗 |
| (4) |
MDCK細胞培養維持液（含Trypsin）：MEM含2μg/ml trypsin |
| (5) |
MDCK細胞：株化細胞，購自ATCC，每次繼代3倍量增殖，培養於25cm2角瓶24小時使用 |
| (6) |
電顯負染色試劑Phosphotungstic acid (24 WO3．2H3PO4．48H2O) |
| (7) |
生理鹽水（或PBS，pH7.2）：8.5% Sodium chloride。 |
| (8) |
紅血球接受器處理酵素RDE (Wellcome Reagenys Ltd) |
| (9) |
Alserver's solution：
| Dextrose |
20.5 |
gm |
| Sodium citrate(Na3C6H5O7‧2H2O) |
8.0 |
gm |
| NaCl |
4.2 |
gm |
| Citric acid(C6H8O7) |
0.55 |
gm |
| Distilled water |
1000 |
ml |
調整pH值為6.1+0.1，0.22過濾膜過濾後保存於4℃ |
| (10) |
神經氨酸分析 (NA) 用相關試劑：
| (a) |
Substrate：12.5 mg/ml fetuin in 0.2 M phosphate buffer （ pH 5.9 ） |
| (b) |
Periodate reagent：0.2 M sodium periodate in 9 M phosphoric acid |
| (c) |
Arsenite reagent：10﹪sodium arsenite in 0.5 M sodium sulfate |
| (d) |
TBA reagent：0.6 % TBA in 0.5 M sodium sulfateWarrenoff reagent：3 % HCl in buthanol |
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| 3. |
病毒分離：
| (1) |
病材：腸內容（糞便）或泄殖腔拭子及喉頭拭子，肺臟、氣囊、腸管、脾、腦、肝及心臟等病材單獨或混雜後處理之 |
| (2) |
病材乳劑製備
| (a) |
病材剪取約1公分立方大小，氣管取5公分長。各臟器分別裝於無菌塑膠袋內。 |
| (b) |
袋內加9ml psgm-PBS（pH7.0~7.4）。 |
| (c) |
以鐵胃擊碎組織，每袋約擊碎30~60秒，至組織完全均質化為止。 |
| (d) |
均質完成之病材乳劑倒至10至15 ml離心管，於4℃ ，1000xg 10分鐘離心。 |
| (e) |
離心後倒取上清液於5 c.c保存瓶內。 |
| (f) |
完成製作之病材乳劑放置4℃隔夜備用，若當日接種用則乳劑與抗生素室溫感作1小時後使用或保存於-60℃以下。 |
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| (3) |
雞胚蛋分離法
| (a) |
9~11日齡SPF雞胚胎蛋在照蛋器燈光透視下，於氣室邊緣上方5mm處，避開血管及胚胎，用紅色蠟筆作一記號。 |
| (b) |
以碘酒棉花擦拭記號周圍，並噴灑70%酒精消毒蛋表面後，以打孔器依記號處打洞。 |
| (c) |
以1c.c針筒抽取病材乳劑0.4ml，由打好之洞，採取與蛋縱軸平行方向插入，將病材乳劑注入0.2ml，每病材接種3至5個蛋。 |
| (d) |
接種完成後，蛋殼上的洞口以石蠟或指甲油封之。 |
| (e) |
放置35 ℃恆溫箱內3日，每日早晚照蛋觀察。接種後24小時以內死亡之雞胚胎蛋不要，24小時以後死亡及3日未死亡之雞胚胎蛋放4 ℃冰箱6小時以上，俟血管收縮後才可準備抽取尿囊液。 |
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| (4) |
收取尿囊液
| (a) |
以70%酒精噴灑每一顆蛋表面。 |
| (b) |
待蛋表面稍乾時，剪刀沾95%酒精以火焰消毒後剪掉氣室端蛋殼。 |
| (c) |
以18~20號針頭之10~20ml針筒抽取尿囊液。 |
| (d) |
尿囊液需測定血球凝集（HA）活性。HA之出現即表示有流行性感冒A型病毒或副黏液病毒(例如新城病Newcastle disease病毒)之存在，如無HA現象，則應再繼代一次，其接種方法如同第一代。 |
| (e) |
收集好之尿囊液分裝於保存瓶內，並做好記號冷凍保存-70 ℃。 |
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| (5) |
MDCK細胞培養分離法：
| (a) |
0.25-0.5ml病材乳劑接種MDCK細胞，感作34℃ 1小時。 |
| (b) |
加入細胞維持培養液(含Trypsin)，每管1ml，置放34℃培養。 |
| (c) |
每日觀察CPE產生，通常接種前幾天不會有CPE，所以可以在接種後3-4天才開始觀察CPE。 |
| (d) |
有CPE者，抽取培養液測其血球凝集活性。 |
| (e) |
最多培養至第七日，即使無CPE者也測其HA活性。 |
| (f) |
HA陽性者測血球凝集力價。 |
| (g) |
無CPE卻有高HA力價者，加入1.0ml細胞維持培養液 |
| (h) |
陽性培養液再接種雞胚蛋或MDCK繼代，以便提高力價。 |
| (i) |
陰性培養液再盲目繼代1-2代。 |
|
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| |
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| 4. |
病原鑑定
| (1) |
電子顯微鏡檢查法： |
| |
家禽流行性感冒為正黏液病毒(Orhtomyxoviruses)，觀察病毒的大小、形態、病毒顆粒直徑及螺旋形核蛋白形態。副黏液病毒(Paramyxoviruses) 大小為100-250 nm，比正黏液病毒(Orhtomyxoviruses) 大，而且較為多形性。經由病毒外套膜(Envelop)可以看見RNA螺旋中心體呈絲狀魚骨樣棒狀排列。
正黏液病毒的外套膜表面突起微大於副黏液病毒。
| (a) |
取血球凝集(HA)陽性之尿囊液0.5ml。 |
| (b) |
使用SS34 離心軸(Rotor)在Sorval RC5高速離心機，離心30,000 g 40分鐘。 |
| (c) |
將沉澱物懸浮於小量的蒸餾水中，取一滴於玻片上，加上一滴Phosphotungstic acid (24 WO3．2H3PO4．48H2O)染色。 |
| (d) |
混合後滴在Grid上，以剪成尖角狀之粗濾紙以毛細現象吸掉多餘液體。 |
| (e) |
放入穿透式電子鏡檢查。 |
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| (2) |
血球凝集(HA)和血球凝集抑制(HI)試驗法： |
| |
家禽流行性感冒病毒具有血球凝集性，且其HA病毒表面結構抗原已知有H1至H15，15種亞型中高病原性家禽流行性感冒通常為H5或H7亞型。以已知15種H亞型之抗血清進行血球凝集抑制試驗鑑定分離病毒之H亞型。
| A. |
標準血清準備：已知H1至H15之抗血清（經處理去除非特異性凝集及非特異性抑制凝集因子） |
| B. |
4HAU的病毒液：HA力價測定法測定後稀釋病毒成4HA單位病毒液 |
| C. |
HA力價測定法：測定病毒的血球凝集力價。
| (a) |
96孔U型盤，每孔加25μl生理鹽水（或PBS，pH7.2）。 |
| (b) |
第1孔加25μl病毒液，以微量稀釋器作連續倍比稀釋，最後1孔25μl丟棄。 |
| (c) |
每孔加25μl生理鹽水（或PBS）。 |
| (d) |
每孔加1﹪雞紅血球懸浮液25μl，振盪均勻，在室溫中放置45~60分鐘後判讀。 |
| (e) |
病毒液血球凝集力價判定方法;病毒與血球凝集會形成凝集平面，當病毒含量漸減時，部分沒有凝集的血球會沉降，完全沒有病毒凝集時，血球則完全沉降成日本國旗樣。完全凝集的最高病毒稀釋倍數即為1HA力價。 |
|
| D. |
血球凝集抑制(HI)試驗：
| (a) |
用4個血球凝集單位（4HAU）的病毒。如病毒血球凝集力價為1：640，4單位為1：160，即使用時需將病毒稀釋到1：160。 |
| (b) |
96孔微量盤，以第2孔開始至第12孔，各加25μl生理鹽水（或PBS）。 |
| (c) |
每一列之第1、2孔分別加處理好的15個不同H亞型標準陽性血清（1：5）25μl，最後一列加入新城病陽性血清，以第2孔開始依次作倍比稀釋，稀釋至第11孔，最後剩餘之25μl丟棄，第12孔為血球對照。 |
| (d) |
除了每一列的第12孔外，其餘孔每孔皆加入4個血球凝集單位待鑑定之病毒液25μl，新城病血清稀釋列則加8個血球凝集單位待鑑定之病毒液25μl，振盪30秒均勻後，在室溫感作25分鐘。 |
| (e) |
每孔加入1%雞紅血球25μl，振盪30秒均勻後，靜置室溫60分鐘後判讀。 |
| (f) |
血球產生沉降列之H亞型即為病毒之H亞型。但因有些病毒的NA抗原會影響HI試驗，引起交叉HI反應，所以若有一列以上不同H亞型判讀有HI情形時，應以同一H不同N亞型的抗血清再進行確認之。 |
| (g) |
對照：血清對照：25μl 1：10稀釋的血清加25μl生理鹽水。
病毒對照：4、2、1、1/2個血球凝集單位的病毒各25μl，再加25μl生理鹽水。
紅血球對照：50μl生理鹽水。以上各對照均再加入25μl的1%雞紅血球懸浮液。 |
| (h) |
結果判定：判讀時將微量盤斜立起，血球如淚滴狀流下者為完全抑制凝集，記錄HI之血清力價，對照之血清及病毒力價要能符合。 |
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| E. |
非特異性血球凝集抑制反應： |
| |
當血清力價小於1/64時，偶爾是屬於非特異性血球凝集抑制反應，此時應使用RDE (Receptor destroying enzyme) 處理血清後再進行一次血球凝集抑制反應。處理後之血清可以使大部分非特異性血球凝集抑制因子去除，若處理後血球凝集抑制反應結果抗體力價仍在，則每群家禽應增加20血清樣本數加以檢測，並配合其他臨床症狀、肉眼病變及病毒學發現才可以下診斷。 |
| |
RDE處理法：
| (a) |
待檢測之血清樣本以RDE (Wellcome Reagenys Ltd) 稀釋1/5，放37 ℃隔夜感作。 |
| (b) |
混合液再以56℃熱度作用 30分鐘使之非動化。 |
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| F. |
1﹪雞紅血球懸浮液製備：
| (a) |
用10 ml注射針筒，23G針頭，抽取0.5-1.0 ml Alserver's solution，以心臟採血法或頸靜脈或翼靜脈採血法抽取新鮮雞血。 |
| (b) |
拔掉針頭，針筒內容物打入5倍量的Alserver's solution內。(例如2 ml血液則加到10ml的Alserver's solution中) |
| (c) |
混合液離心500g 5分鐘。 |
| (d) |
除去上清液，並用細小之吸管吸掉白血球層。 |
| (e) |
將紅血球細胞懸浮於冰冷的生理鹽水或磷酸緩衝液 (PBS) 中，重複兩次離心步驟。 |
| (f) |
最後生理鹽水或以磷酸緩衝液將紅血球細胞稀釋成1﹪濃度之懸浮液，作為血球凝集及血球凝集抑制試驗使用。 |
| (g) |
雞紅血球懸浮液應保存於4℃，48小時以內使用。 |
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|
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| (3) |
神經氨酸分析 (NA) 及神經氨酸抑制分析 (NI) ： |
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家禽流行性感冒病毒NA表面抗原有9種不同亞型(N1-N9)，以NI法鑑定N之亞型，本法亦需有標準的 N1~N9 抗血清才能進行，進行NI試驗前，需先測定病毒的N活性，以決定病毒進行NI時的稀釋倍數。
| A. |
神經氨酸分析 (NA) 實施方法：
| (a) |
病毒液2倍連續稀釋於PBS。 |
| (b) |
每一稀釋取25ul至16×150mm玻璃試管。 |
| (c) |
加50ul substrate。 |
| (d) |
混合，然後置37 ℃ 30分鐘（或隔夜）。 |
| (e) |
加50ul periodate reagent，混合後，在室溫感作20分鐘（此時開始準備沸水）。 |
| (f) |
加0.5ml arsenite reagent，振盪至棕色消失為止。 |
| (g) |
加1.25ml TBA reagent，混合之。 |
| (h) |
置於沸水中煮15分鐘。 |
| (i) |
冰浴中冷卻，加1.5ml Warrenoff reagent混合均勻至粉紅色出現。 |
| (j) |
1000rpm離心10分鐘取上層。 |
| (k) |
在549nm波長光度機讀取吸光值，吸光值在0.45~0.8之間的病毒稀釋倍數為NI用病毒濃度。 |
|
| B. |
神經氨酸抑制分析 (NI)
| (a) |
已知N亞型血清（ N1~N9 ）稀釋成10-2。 |
| (b) |
每一稀釋之標準血清取25μl至2支試管。 |
| (c) |
加25μl上述稀釋定量好之病毒，混合後，置室溫中1小時。 |
| (d) |
加50μl substrate，混合後，置37 ℃ 30分鐘（或隔夜）。 |
| (e) |
加50μl periodate reagent，混合均勻，置室溫中20分鐘（此時開始準備沸水）。 |
| (f) |
加0.5ml arsenite reagent，振盪至棕色消失。 |
| (g) |
加1.25ml TBA reagent，混合之。 |
| (h) |
置於沸水中煮15分鐘。 |
| (i) |
結果：呈粉紅色表示抗血清無抑制作用，無粉紅色表示血清有抑制作用，由結果來判定N亞型。 |
|
|
| |
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| (4) |
靜脈內接種病原性指數（ IVPI ）： |
| |
鑑定家禽流行性感冒對雞的致病性。 IVPI 越高表示對雞的毒性越高。
| (a) |
以生理食鹽水10倍稀釋新鮮感染病毒之尿囊液。 |
| (b) |
10隻6週齡SPF雞，每隻靜脈接種0.1ml。 |
| (c) |
接種後每24小時觀察一次雞隻健康情形，持續觀察十天，並每日紀錄每隻雞隻發病情形，HPAI之臨床症狀有呼吸症狀、沈鬱、下痢、肉垂發紺、頭或臉水腫或神經症狀。 |
| (d) |
發病程度之觀察判斷通則如下：若雞僅呈現一種症狀時判讀為"發病"；出現一種以上症狀時則判讀為"嚴重發病"。 |
| (e) |
IVPI 計算法，正常：0分；發病：1分；嚴重發病：2分；死亡：3分。計算每隻接種雞每天之平均分數。 |
|
|
|
| |
家禽流行性感冒血清學方法AGP及ELISA檢測抗病毒核蛋白抗體，無法檢測亞型抗體，若要檢測特殊亞型抗體需以HI法行之，但HI法仍會受N抗體的影響出現抗體交叉性，無論如何抗體檢測僅可做為輔助診斷，不適宜做為最終之確診用。
| 1. |
材料與設備
| (1) |
均質機 |
| (2) |
超音波擊碎機 |
| (3) |
5000rpm離心機 |
| (4) |
保濕盒 |
| (5) |
37 ℃恆溫箱 |
| (6) |
直徑9公分平皿 |
| (7) |
凝膠打孔器 |
| (8) |
暗室 |
| (9) |
-20℃冰箱 |
| (10) |
微波爐 |
| (11) |
ELISA判讀機 |
| (12) |
96孔平底微量檢測盤(ELISA用) |
| (13) |
96孔V底微量檢測盤(HI檢測用) |
| (14) |
8爪20-200μl微量分注器(Coster) |
|
| |
|
| 2. |
試劑
| (1) |
福馬林 |
| |
|
| (2) |
磷酸緩衝液：
| NaCl |
(Merck) |
8.0 |
gm |
| KCl |
(Merck) |
0.2 |
gm |
| Na2HPO4.7H2O |
(Merck) |
2.17 |
gm |
| KH2PO4 |
(Merck) |
0.2 |
gm |
| 加蒸餾水至 |
|
1,000 |
mL |
以121℃ 15磅/cm2高壓滅菌20分鐘。 |
| |
|
| (3) |
AGP抗原製備Sodium lauroyl sarcosinate緩衝液
| 0.5 M glycine(以1 N NaOH調pH至9.0) |
20 |
ml |
| 10﹪Sodium lauroyl sarcosinate |
5 |
ml |
|
| |
|
| (4) |
AGP試驗用8﹪食鹽agar溶液
DW up to 100 ml，高溫高壓滅菌後製備凝膠用 |
| |
|
| (5) |
ELISA用試劑：
| Disruption buffer： |
0.05M Tris-HCL（pH7.8）Triton X-100,0.6M KCL |
| PBST ： |
0.05 % Tween 20 加於 PBS （pH 7.2）中 |
| BSA10： |
牛血清蛋白 fraction V 10 mg/ml 溶於 PBS |
| BSA5T： |
Bovine serum albumin 5 mg/ml in PBST |
| Conjugate： |
Goat anti-rabbit globulin cojugated to horseradish peroxidase |
| Substrate： |
10 ml citrate buffer （0.05 M, pH4.0）+ 40ul 1% H2O2 +50ul ABTS（40m M） 2,2 - Azino - di - 3ethyl- benzothiazoline-6-sulphuric acid0.1M HF（pH3.3） |
|
| |
|
| (6) |
HI檢測試劑：
1﹪雞紅血球懸浮液
Saline |
|
| |
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| 3. |
膠內免疫擴散法（AGP）
| (1) |
AGP抗原製備：
| (a) |
取任何一種亞型的AI病毒株，以尿囊腔接種9~11日齡雞胚胎於35℃培養3天 |
| (b) |
分開收集感染之尿囊液及絨毛尿囊膜（CAM）。 |
|
| |
|
| (2) |
以CAM製備AGP抗原：
| (a) |
CAM以均質機研碎，加磷酸緩衝液製成五倍乳劑。 |
| (b) |
急速冷凍解凍三次或以超音波擊碎機充分擊碎 |
| (c) |
經1,000g離心10分鐘 |
| (d) |
吸取上清液添加福馬林0.1﹪，即為本法之AGP抗原 |
| (e) |
分裝儲存於-20℃冷凍櫃備用。 |
|
| |
|
| (3) |
以尿囊液製備AGP抗原：
| (a) |
將1.0N HC1加入尿囊液，使pH下降至4.0，通常每毫升尿囊液加0.03 ml之1.0N HC1。置入冰箱一小時。 |
| (b) |
以1,000g，4 ℃離心十分鐘，倒棄上清液。 |
| (c) |
沈渣以Sodium lauroyl sarcosinate緩衝液（原尿囊液1%）溶解，再加formalin 0.1﹪處理後即為可溶性抗原。 |
|
| |
|
| (4) |
AGP凝膠製作：
| (a) |
8﹪食鹽agar溶液經高壓滅菌後，趁熱倒入平皿，每一直徑9公分平皿倒入15ml。 |
| (b) |
agar凝固後，挖取中央一洞周圍六洞，每洞直徑0.5公分，周圍與中央洞距0.5公分。 |
| (c) |
中央洞滴入AGP抗原，周圍洞滴入血清，每洞滴入50μl，每個待測血清旁需有一個已知陽性血清。 |
| (d) |
置入保鮮盒內，放37 ℃恆溫箱2-3天後判讀。 |
| (e) |
與陽性血清形成連續一致之沉降線者，是為具有AI抗體。 |
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| 4. |
酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) |
| |
ELISA檢測沒有亞型特異性，只能証實有A型的AIV抗體存在。本法有市售商品化之AI ELISA套組(KPL或IDEXX產品)可使用。
| (1) |
抗原製造及包被： |
| |
取單一標準株或混合株病毒感染雞胚的尿囊液，30,000rpm離心2小時。沉澱物溶於TNE緩衝液（Tris 0.01M、NaCl 0.1M、EDTA 0.001M，pH7.4）。再通過25~40%的蔗糖梯度離心20,000rpm 2小時，收集病毒帶，TNE緩衝液透析。測HA，包被抗原濃度為100HAU/well。血清100倍稀釋。 |
| (2) |
操作方法
| (a) |
抗原原液測定HA力價，將抗原以Disruption buffer稀釋為100 HAU/50μl。 |
| (b) |
ELISA用96孔盤每孔加抗原50μl使抗原吸附於盤內，4℃隔夜或室溫1小時感作。 |
| (c) |
吸取抗原，各孔加BSA10 100ul，室溫blocking 1小時。 |
| (d) |
以PBST洗淨3次。 |
| (e) |
被檢抗體（血清）用BSA5T稀釋，每孔加50μl，室溫作用1小時。 |
| (f) |
以PBST洗淨4次。 |
| (g) |
每孔加Conjugate 50μl，室溫感作1小時。 |
| (h) |
以PBST洗淨4次。 |
| (i) |
每孔加Substrate solution 100μl，作用15-30分鐘後加0.1M HF（pH3.3）50μl使反應停止。以OD 405nm光度計測定吸光值。 |
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| 5. |
血球凝集抑制(HI)抗體檢測法： |
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以上AGP或ELISA檢測AI抗體陽性之血清，若要確定H亞型抗體（尤其H5及H7抗體），則行HI試驗法來檢測之。需使用要檢測之H亞型特異抗原來進行檢測，但抗原的N亞型仍會影響HI試驗，產生交叉反應之情形。
| (1) |
HI抗原： |
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選取要檢測用之H亞型病毒株，以雞胚蛋增殖收取尿囊液加入0.01﹪福馬林非動化，作用室溫3天以上。2,000 rpm 低速離心20分鐘去除雜質，上清液測定血球凝集力價，血球凝集力價需達160倍以上。最後此非動化之病毒液加等量glycerol，分裝存-20℃做為HI抗原使用。 |
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| (2) |
術式：
| (a) |
測HI抗原之HA力價，HA力價測定法如本標準病毒鑑定之HA及HI法所述。以生理鹽水（或PBS）稀釋為4個血球凝集單位（4HAU）。 |
| (b) |
96孔V底微量盤，以每孔各加25μl生理鹽水（或PBS）。 |
| (c) |
各個待測雞血清分別加入第1孔內25μl，由第1孔開始依次作25μl 2倍連續稀釋，稀釋至第11孔，最後剩餘之25μl丟棄，第12孔為血清對照。 |
| (d) |
除了第12孔外，其餘孔每孔皆加入4個血球凝集單位抗原液25μl，振盪30秒均勻後，在室溫感作25分鐘。 |
| (e) |
每孔加入1%雞紅血球25μl，振盪30秒均勻後，靜置室溫60分鐘後判讀。 |
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| (3) |
對照： |
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血清對照：每一列最後一孔 25μl血清加25μl生理鹽水。 |
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病毒對照：4、2、1、1/2個血球凝集單位的病毒各25μl，再加25μl生理鹽水。 |
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紅血球對照：50μl生理鹽水 |
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以上各對照均再加入25μl的1%雞紅血球懸浮液。 |
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| (4) |
結果判定：判讀時將微量盤斜立起，血球如淚滴狀流下者為完全抑制凝集，記錄HI之血清力價，對照病毒力價要能符合。 |
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| (5) |
非特異性血球凝集抑制反應： |
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當血清力價小於1/64時，偶爾是屬於非特異性血球凝集抑制反應，此時應使用RDE (Receptor destroying enzyme) 處理血清後再進行一次血球凝集抑制反應。處理後之血清可以使大部分非特異性血球凝集抑制因子去除，若處理後血球凝集抑制反應結果抗體力價仍在，則每群家禽應增加20血清樣本數加以檢測，並配合其他臨床症狀、肉眼病變及病毒學發現才可以下診斷。 |
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RDE處理法：待檢測之血清樣本以RDE (Wellcome Reagenys Ltd) 稀釋1/5，放37 ℃隔夜感作。混合液再以56℃熱度作用 30 分鐘使之非動化後使用。 |
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| 1. |
動物傳染病診斷標準。雲林縣家畜疾病防治所彙編。 |
| 2. |
禽病檢查手冊。宋華聰、林茂勇編校。藝軒圖書出版社。1995。 |
| 3. |
Advanced Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis. U.S. department of Health, Education and Welfare. Public Health Service, Center for Disease Control Burean of Laboratories, Atlanta, Georgia. 1975. |
| 4. |
Concepts and Procedures for Laboratory- Based Influenza Surveillance. U.S. department of Health, Education and Welfare. Public Health Service, Center for Disease Control Burean of Laboratories, Atlanta, Georgia.1982. |
| 5. |
Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Office International des Epizooties, World Organisation for Animal Health. 1997. |
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| 1. |
血清學試驗： |
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方法：ELISA或AGP陽性血清再測H5或H7之HI抗體檢測，抗體力價出現64倍以上判定感染。 |
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| 2. |
病毒學試驗： |
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方法：
| A. |
RT-PCR陽性檢體需進行病毒分離鑑定病毒亞型及病原性鑑定。 |
| B. |
病毒分離：雞胚蛋培養分離法。 |
| C. |
病毒鑑定：TEM、HA&HI。 |
| D. |
病原性鑑定： IVPI 、HA氨基酸序列分析。 |
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| 3. |
病毒確認： |
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間接螢光抗體試驗 |
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