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傳染性華氏囊病實驗室診斷標準操作程序（以下簡稱本標準）所制訂之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行傳染性華氏囊病病毒分離鑑定及血清學試驗操作時參考之程序。 |
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| 1. |
傳染性華氏囊病(infectious bursal disease ,IBD)： |
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傳染性華氏囊病亦稱甘保羅病(Gumboro disease)，雖然雞、火雞、鴨、珠雞均可被感染，但只有雞感染會有臨床症狀，而且只有小雞會被感染。嚴重又急性的IBD通常引起高死亡率，但是一般較常見的是亞急性或無臨床症狀的IBD。由於病毒感染免疫器官華氏囊(bursa of Fabricius)，故本病常造成二次感染的問題。 |
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| 2. |
傳染性華氏囊病病毒： |
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是一種雙股RNA病毒，被歸類於Birnaviridae。傳染性華氏囊病病毒會造成華氏囊之淋巴組織減損，如果此情形發生在2週齡之內的小雞，體液抗體(humoral antibody)反應就會被嚴重的抑制。目前傳染性華氏囊病病毒有兩種血清型，引起臨床疾病並且已有疫苗可使用的是IBD第一型。近來研究顯示有IBD第一型血清變異株發生，此需特別疫苗來做最大的保護，在許多國家IBD病毒非常強之毒株已經出現並且導致發生嚴重的病亦超過10年。 |
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本病可由特異的症狀與死後病變來作初步診斷。實驗室確診或無臨床症狀感染的偵測，可由體液免疫反應或組織內病毒抗原檢測來証明，若沒有這些試驗，華氏囊組織病理切片亦有所幫助。
| 1. |
材料與設備
| (1) |
37℃恆溫箱 |
| (2) |
孵蛋箱（恆溫35~37°C） |
| (3) |
照蛋器 |
| (4) |
打孔器 |
| (5) |
5000rpm離心機 |
| (6) |
超低溫冰櫃(-70~-100℃) |
| (7) |
倒立式光學顯微鏡 |
| (8) |
研缽 |
| (9) |
3-7週齡無特定病原雞與經IBD免疫過的雞 |
| (10) |
IBD抗體陰性之6至8日及9至11日齡雞胚胎 |
| (11) |
雞胚胎纖維芽細胞(CEF)培養於25cm2角瓶 |
| (12) |
螢光顯微鏡 |
| (13) |
吸管(1.2.5.10.20ml) |
| (14) |
1.c.c無菌注射針筒（針頭5/8×25G） |
| (15) |
10c.c無菌注射針筒(針頭18~20G×11/2) |
| (16) |
石臘或指甲油 |
| (17) |
70%酒精 |
| (18) |
碘酒棉花 |
| (19) |
14cm手術剪刀 |
| (20) |
-20℃冰箱 |
| (21) |
暗室 |
| (22) |
冷凍切片機 |
| (23) |
保濕盒 |
| (24) |
穿透式電子鏡 |
| (25) |
50000rpm 高速離心機 |
| (26) |
超微切片機 |
| (27) |
Grid |
| (28) |
粗濾紙 |
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| 2. |
試劑：
| (1) |
伊耳氏平衡鹽液(GIBCO) |
| (2) |
組織細胞培養液：每包 1 公升裝 MEM 鹽基粉末(GIBCO)加入滅菌再製蒸餾水至 1 公升。經溶解後加入 2.3 gm 的 NaHCO3，以 0.22μ Millipore 過濾並分裝於 500 mL 血清瓶內，TSA Agar無菌檢定通過後放入 4 ℃ 冰箱備用。 |
| (3) |
病材乳劑緩衝液：PBS中添加penicillin (10,000iu/ml)，streptomycin (1,000μg/ml)及0.5% (W/V)牛白蛋白，最後調整pH7.2，0.45μm濾膜過濾，保存於4℃ |
| (4) |
中性福馬林(Fisher) |
| (5) |
IBDV抗血清 |
| (6) |
甲醇(Merck) |
| (7) |
冰冷丙酮：丙酮(Merck)放置於-20℃冰箱 |
| (8) |
IBDV-FITC螢光標示抗體 |
| (9) |
PBS：
| NaCl |
(Merck) |
8.0 |
gm |
| KCl |
(Merck) |
0.2 |
gm |
| Na2HPO4.7H2O |
(Merck) |
2.17 |
gm |
| KH2PO4 |
(Merck) |
0.2 |
gm |
| 加蒸餾水至 |
|
1,000 |
mL |
以121 ℃ 15 磅 / cm2高壓滅菌20分鐘。 |
| (10) |
電顯用固定液：2﹪formaldehyde |
| (11) |
電顯負染色液： Phosphotungstic acid (24 WO3．2H3PO4．48H2O) |
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| 3. |
病毒分離：
| (1) |
病材準備：
| (a) |
以無菌操作摘取5個早期感染之華氏囊，將它切碎。 |
| (b) |
加入少量含有抗生素(penicillin 1000 unit/ml與streptomycin 1,000μg/ml)及0.5%(W/V)牛白蛋白之磷酸緩衝液(PBS, pH7.2 )，以研缽將其磨碎均質化，做成10倍乳劑，保存於-20℃。 |
| (c) |
使用前將此均質液以3,000g離心10分鐘，回收上清液，用做後續的檢驗。 |
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| (2) |
細胞培養分離法：
傳染性華氏囊病病毒可培養於華氏囊細胞(BF)及雞胚胎腎細胞(CEK)或雞胚胎纖維芽細胞(CEF)，但培養之前兩代可能無細胞病變效應(CPE)產生，可用免疫螢光染色法來鑑定，免疫螢光染色法於接種後48小時進行之。
| (a) |
取4支長滿無特定病原雞(SPF)來源之雞胚胎纖維芽細胞(CEF) 25cm2組織培養瓶，各接種0.5ml樣品，在37℃吸附30分鐘。 |
| (b) |
以伊耳氏平衡鹽液洗2次。 |
| (c) |
加入細胞維持液，放37℃恆溫箱培養。 |
| (d) |
每日於倒立式光學顯微鏡下觀察是否有細胞病變效應(cytopathic effect ,CPE)，若有則會有圓形折射性細胞出現。 |
| (e) |
觀察6天後仍沒有CPE，則將它冷凍解凍後溶液接種新的細胞，此步驟可能需要重複至少3次。 |
| (f) |
若發現CPE，則病毒應以IBD血清進行中和試驗 (virus neutralization ,VN) 鑑定病毒。 |
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| (3) |
雞胚胎分離法：
本法為IBDV例行性分離診斷最常使用之方法，但需連續繼代則較費時。
| (a) |
取5個IBD抗體陰性之6至8日齡雞胚胎，接種0.2ml樣品入卵黃囊。 |
| (b) |
同時取5個IBD抗體陰性之9至11日齡雞胚胎，接種0.2ml樣品入絨毛漿尿膜上。 |
| (c) |
每日照蛋，48小時以內死亡者丟棄，胚胎在接種後2日至7日死亡者收集雞胚胎及絨毛漿尿膜，第7日以後雞胚仍活存之雞胚乳劑繼續繼代，最多繼5代來檢查病變。 |
| (d) |
胚胎通常於接種後3至6日死亡。IBD可造成胚胎矮化、皮下水腫、充出血。肝臟腫大，呈斑點狀出血。若死亡較晚者則肝臟呈綠色腫大，並有壞死。腎腫大且斑狀充血、脾亦腫大。 |
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| |
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| (4) |
雞隻分離法：此方法分離IBD病毒最簡單。
| (a) |
取5隻有感受性的雞與5隻經IBD免疫過的雞（3-7週齡）， 以點眼、口服、點肛或肌肉注射方式，每隻雞接種0.05ml樣品，其中以點眼方式接種最常使用。 |
| (b) |
接種後72-80小時，剖檢華氏囊，檢查華氏囊病變；病毒感染的華氏囊呈黃色（有時出血）腫大，有明顯的細溝，華氏囊周邊水腫亦常見，華氏囊內有時可見乳酪化物質，華氏囊褶襞有出血點。 |
| (c) |
若有感受的雞呈現此病變，同時免疫過的雞沒有病變則可診斷為IBD。 |
| (d) |
另一方法為取3-5週齡無IBD抗體雞隻10隻，以點眼、口服、點肛或肌肉注射方式，每隻雞接種0.025ml樣品，接種後第0、3、5、7日各檢查2隻雞之華氏囊肉眼病變及組織學病變，取下之華氏囊一部份放中性福馬林重做組織病理檢查用，另一部份保存於-20℃冷凍。 |
| (e) |
上法判定華氏囊病變，若無病變者表示非IBD。 |
| (f) |
病毒鑑定：將產生華氏囊病變結果之病材用已知IBD陽性抗血清處理中和後，再接種雞胚胎或雞隻鑑定是否為IBDV。 |
| (g) |
組織染色可在CPE附近的細胞核內看到Cowdry's type A的核內包涵體，以及多核巨大細胞 (polykaryocyte)。 |
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| 4. |
病毒鑑定：
| (1) |
免疫螢光法(IF)：
| (a) |
試材：組織培養細胞接種病材產生CPE時，棄培養液以甲醇固定組織10分鐘，或病材接種隻雞隻華氏囊病材以冷凍切片機切片及以冰冷丙酮固定。 |
| (b) |
染色步驟；將標示FITC螢光抗體適倍量稀釋（通常稀釋1000倍）滴於此已固定之待測培養細胞上。 |
| (c) |
置於保濕盒，密封蓋緊，放37℃感作1小時後，取出以PBS緩衝溶液浸洗三次，每次五分鐘。 |
| (d) |
在螢光顯微鏡下觀察，特異蘋果綠色螢光可在感染細胞的細胞質出現。 |
|
| |
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| (2) |
凝膠免疫擴散法(AGP)：
| (a) |
檢測華氏囊內抗原：取10隻急性感染期之華氏囊，切碎研磨後，置於AGID盤內孔洞中以陽性血清檢測。 |
| (b) |
試驗步驟如血清學試驗四-4。 |
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| |
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| (3) |
電子顯微鏡觀察：
| (a) |
將華氏囊病材或經接種之雞胚胎做成乳劑或接種細胞液，先以10000-11500rpm 高速離心取上清。 |
| (b) |
再以30000-35000rpm 離心2小時，取沉澱物。 |
| (c) |
將沉澱物懸浮於小量的蒸餾水中，取一滴於玻片上，加上一滴Phosphotungstic acid (24 WO3．2H3PO4．48H2O)染色。 |
| (d) |
混合後滴在Grid上，以剪成尖角狀之粗濾紙以毛細現象吸掉多餘液體。 |
| (e) |
放入穿透式電子鏡檢查。 |
| (f) |
或將上述病材先以2﹪formaldehyde在4℃固定至少2小時，製作超微切片，以電子顯微鏡觀察。 |
| (g) |
病毒顆粒70nm大小，無封套，正20面體。 |
|
|
|
| |
本病在一群雞中通常散佈快速。因此只需要測定一小部份雞血清即可。未免疫雞隻若是發現陽性反應，就視為整群雞均被感染。
| 1. |
材料與設備
| (1) |
5000rpm離心機 |
| (2) |
熱水槽(50-100℃) |
| (3) |
均質機 |
| (4) |
-40℃冷凍庫 |
| (5) |
-20℃冰箱 |
| (6) |
37℃ 5﹪CO2恆溫箱 |
| (7) |
3-5週齡SPF小雞 |
| (8) |
9cm塑膠平皿(Petri dish)或25×75mm之載玻片 |
| (9) |
天秤 |
| (10) |
保鮮盒 |
| (11) |
無菌96孔平底組織培養微量盤 |
| (12) |
計時器 |
| (13) |
ELISA reader (Titertek Multiscan) |
| (14) |
20-200μl八爪微量分注器(Coster) |
| (15) |
研缽 |
| (16) |
暗室 |
| (17) |
透明膠帶（8-12cm 寬） |
| (18) |
4℃冰箱 |
|
| |
|
| 2. |
試劑：
| (1) |
Methylene chloride蒸餾水 |
| (2) |
磷酸緩衝溶液 (phosphate buffered isotonic saline , PBS , pH 7.0-7.4)：
| NaCl |
(Merck) |
8.0 |
gm |
| KCl |
(Merck) |
0.2 |
gm |
| Na2HPO4.7H2O |
(Merck) |
2.17 |
gm |
| KH2PO4 |
(Merck) |
0.2 |
gm |
| 加蒸餾水至 |
|
1,000 |
mL |
以121 ℃ 15 磅 / cm2高壓滅菌20分鐘。並以T.S.A. Agar 作無菌檢定。 |
| (3) |
病毒中和試驗相關試劑：
| (a) |
M199組織培養液：medium199（GIBCO）中加
10﹪tryptose phosphate broth
1.5﹪的5.6﹪碳酸鈉溶液
0.5﹪的0.3M Hepes solution
penicillin 100μg/ml
streptomycin 100μg/ml
fungizone 2.5μg/ml
使用時另加l2﹪fetal calf serum(經熱非動化過) |
| (b) |
IBD病毒液：IBDV-GT101(或IBD其他標準病毒株)，以M199組織培養液稀釋成每25μl含100 TCID50（50﹪組織培養感染劑量）的病毒液 |
| (c) |
CEF細胞懸浮液：將10日齡雞胚胎去頭去四肢後以Trypsin消化組織製成之單一或小細胞團懸浮液，細胞用M199組織培養液洗一次並懸浮成75x104細胞/ml |
| (d) |
1﹪Crystal violet溶液：95﹪酒精100ml加1gmCrystal violet (1﹪) |
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| (4) |
凝膠：
| 氯化鈉（NaCl） |
80 |
克 |
| 石碳酸（phenol） |
5 |
克 溶於1升之蒸餾水，加凝膠(Noble agar) 12.5克 |
煮沸直至完全溶解，20ml小分裝至玻璃內，4℃保存備用。 |
| (5) |
酵素連結免疫分析(ELISA)相關試劑：
| (a) |
IgG兔抗IBDV高免血清：兔子之IgG以blue dextran (Pharmacia) 或protein A (Pharmacia)色層分析管柱純化獲得。 |
| (b) |
0.05M Carbonate- bicarbonate buffer (pH9.6) |
| (c) |
0.05﹪Tween 20之PBS (PBST) |
| (d) |
5﹪脫脂奶粉 |
| (e) |
綿羊抗雞Ig Conjugated horseradish peroxidase (KPL) |
| (f) |
Recrystallised 5- aminosalicyclic acid (Merck) |
| (g) |
0.1M hydrogen peroxide (H2O2) |
|
|
| |
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| 3. |
病毒中和試驗
| (1) |
試驗步驟
| (a) |
病毒稀釋成每0.05ml含有100 TCID50分裝入96孔組織培養盤，每孔0.05ml。 |
| (b) |
待測血清先以56℃ 30分鐘非動化後，在分裝好病毒的96孔盤中2倍連續稀釋血清，37℃ 感作1小時。 |
| (c) |
感作後每孔加入0.2ml雞胚胎纖維芽細胞懸浮液(CEF)後，置於37℃ 5﹪CO2恆溫箱培養4至5天。 |
| (d) |
去除盤內各孔之培養液，加入0.05ml 1﹪結晶紫染色液染色1分鐘。 |
| (e) |
用水緩和洗數次，最後使其乾燥。 |
|
| |
|
| (2) |
判讀：
| (a) |
當細胞存在時，結晶紫染劑染在細胞上會呈現暗紫色，當細胞死亡脫落，只有輕微染色或無色。 |
| (b) |
判讀每個血清列最後暗紫色孔的血清稀釋倍數，血清完全被病毒中和之稀釋倍數的倒數是為血清力價。 |
|
| |
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| (3) |
對照：
| (a) |
陽性及陰性對照 |
| (b) |
病毒對照：病毒原液稀釋成10-2至10-9做四重複，以確定試驗中加入的病毒量對否。 |
| (c) |
血清對照：初步稀釋的血清與CEF感作，不加病毒，檢測血清對細胞的毒性作用。 |
|
|
| |
|
| 4. |
凝膠免疫擴散試驗
| (1) |
檢測血清樣品：採取感染早期及感染3週後之血清樣品各20個。 |
| (2) |
檢測華氏囊內抗原：取10隻急性感染期之華氏囊，切碎研磨後，置於AGID盤內孔洞中以陽性血清檢測。 |
| (3) |
陽性對照抗原之準備：
| (a) |
取IBD病毒感染之華氏囊加磷酸緩衝液，研磨成10%均質液 |
| (b) |
離心3000g 10分鐘，取上清液 |
| (c) |
上清液點眼接種3-5週齡有感受性之小雞。 |
| (d) |
接種後3天無菌摘取華氏囊，出血的華氏囊丟棄，其它集合後稱重 |
| (e) |
加入等量之冷蒸餾水，再加一份等量之Methylene chloride，在均質機打碎混合後，以2,000g離心30分鐘，取上清液小分裝後-40℃冷凍保存。 |
|
| (4) |
陽性對照抗血清之準備
| (a) |
將IBD病毒感染之華氏囊做成10%均質液，離心3000g 10分鐘 |
| (b) |
取上清液點眼接種4-5週齡SPF小雞，每隻接0.05ml |
| (c) |
接種後28天採血，將血清小分裝置於-20℃保存。 |
|
| (5) |
試驗步驟
| (a) |
試驗前24小時至7天準備平板，將凝膠置於沸水浴溶解。 |
| (b) |
將9cm塑膠平皿 (Petri dish) 置於水平桌面，1瓶凝膠20ml，倒入一膠質平板（或將凝膠加在25×75mm之載玻片上，打直徑3mm孔，孔距6mm）。 |
| (c) |
將平皿蓋上蓋子，凝膠凝固後保存於4℃備用。此可儲存7天（如果凝膠平皿當天就要使用，可將平皿打開倒置於37℃溫箱乾燥30分鐘至1小時即可使用）。 |
| (d) |
用圓柱狀切割器切割出三排垂直的孔。 |
| (e) |
切出的凝膠，從孔中去除，必需注意不可將孔壁破壞。 |
| (f) |
加待測血清至孔中9分滿，或加華氏囊乳劑待測抗原到孔中9分滿。 |
| (g) |
加陽性與陰性對照入相關孔中。每一待測血清或華氏囊乳劑均應排列在陽性抗體與抗原之旁邊。 |
| (h) |
將平皿置於22℃至37℃之保鮮盒中感作48小時。 |
| (i) |
將平皿置於暗背景與斜光源之上觀察判讀沉降線。 |
|
|
| |
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| 5. |
酵素連結免疫分析(ELISA)：本法用於檢測感染組織內IBDV
| (1) |
試驗步驟：
| (a) |
在室溫中以平底96孔塑膠微量盤進行，盤底包覆100μl IgG兔抗IBDV高免血清，兔抗IBDV高免血清先以0.05M Carbonate- bicarbonate buffer (pH9.6) 稀釋。 |
| (b) |
包覆後之盤子用透明寬膠帶封緊，放置室溫隔夜。 |
| (c) |
盤子用含0.05﹪Tween 20之PBS (PBST)洗3次，洗液停置盤內至少1分鐘。 |
| (d) |
IBD抗原用過濾過之洗液加5﹪脫脂奶粉稀釋（稀釋液）後，每孔加100μl。 |
| (e) |
盤子感作1小時後，以洗液洗3次。 |
| (f) |
抗血清以稀釋液倍比連續稀釋，加100μl至盤內。 |
| (g) |
盤子再感作1小時，以洗液洗3次。 |
| (h) |
綿羊抗雞Ig Conjugated horseradish peroxidase (KPL) 以稀釋液稀釋1：1000後，每孔加100μl。 |
| (i) |
感作1小時後，以洗液洗3次，最後一次用蒸餾水洗。 |
| (j) |
Recrystallised 5- aminosalicyclic acid (Merck) 加入預先泡好的0.1M hydrogen peroxide (H2O2) 0.2 ml，再加入盤子每孔100μl。 |
| (k) |
放震盪器上震盪30分鐘後，在450nm波長ELISA reader (Titertek Multiscan)判讀OD值。 |
|
| |
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| (2) |
ELISA試劑稀釋濃度及對照設定：
| (a) |
以上所使用的每批包覆抗體、IBDV抗原及抗雞Ig conjugate等試劑皆須先測定其最適當使用濃度，在背景值為最小的情況下，其OD值最大在1.10- 1.20之間。 |
| (b) |
陰性血清或低濃度抗體血清通常稀釋1：200，結合背景值時ELISA終點取0.15 OD。 |
| (c) |
對照孔需無抗原但有包被抗體、雞血清及Conjugate。 |
| (d) |
只有雞血清的孔可以省略掉，而以只有稀釋液的孔取代之。 |
| (e) |
每列剩下來除了有加過Substrate者以外，其他未經處理的孔可以作為reader的'Blanked'。 |
| (f) |
ELISA法檢測抗體與中和試驗法檢抗體一樣敏感，兩種方法之敏感性皆大於凝膠免疫擴散法100倍。 |
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| 1. |
動物傳染病診斷標準。雲林縣家畜疾病防治所彙編。 |
| 2. |
禽病檢查手冊。宋華聰、林茂勇編校。藝軒圖書出版社。1995。 |
| 3. |
Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Office International des Epizooties, World Organisation for Animal Health. 1997. |
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| 1. |
血清學試驗 |
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方法：病毒中和試驗(VN)、ELISA或AGP抗體抗體呈現陽性。 |
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| 2. |
病毒學試驗
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方法：接種於10-12日齡雞胚胎、已形成單層細胞之BHK-21、VERO細胞等株化細胞。
| A. |
RT-PCR陽性檢體需進行定序 |
| B. |
病毒分離：雞隻接種分離法、雞胚胎分離法、雞胚胎纖維芽細胞(CEF)培養分離法。 |
| C. |
病毒鑑定：IF、TEM、RT-PCR。 |
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