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家禽霍亂

作者
吳義興
建立日期
96年01月11日
更新日期
96年01月11日
內容
目的
家禽霍亂之診斷及其病原細菌分離與鑑定標準操作程序（以下簡稱本標準）所制訂之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行家禽霍亂病原細菌之分離及鑑定操作時所必須之程序，以確保實驗室診斷之正確性。
 
名詞定義
1. 家禽霍亂(Fowl cholera)：
又稱多殺性巴氏桿菌感染症(Pasteurella multocida infection)，係由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)所引起之傳染病。
2. 兼性厭氧菌：厭氧細菌但亦可在有氧情況下發育增殖者。
3. 初代分離培養：直接由病材檢体中，分離病原之謂。
4. 純化培養：將初代分離培養經確認為目標病原後，做純化繼代培養。
5. 增菌培養：將純化培養經確認為目標病原後，以液体培養基培養，以求短期內，目標病原菌數增加。
6. 醣類發酵試驗：將醣類 1 % 加於適當之培養基以檢測細菌對該醣類之分解及利用。
7. Wright 染色：樣品之塗抹片直接放入 wright 染色液中染約 1 分鐘後，水洗即可。
8. Giemsa 染色：樣品之塗抹片以甲醇固定五分鐘，再以新鮮 20 倍稀釋之 Giemsa 染色液中染 1-2 小時後，水洗即可鏡檢。
9. Methylene blue 染色：以火焰固定之抹片，使用 Methylene blue 染色液染 1 分鐘後，水洗即可觀察，細菌呈深藍色。
 
設施及材料
1. 實驗室：符合國家安全標準二級負壓隔離實驗室。
2. 遠心機：HERMLE ZK380。
3. 顯微鏡：OLYMPUS BH-2。
4. wright 染色液：Sigma 或 Merck。
5. Giemsa 染色液：Sigma 或 Merck。
6. Methylene blue染色液： Mehtylene blue 0.3 gm 溶於30ml 之 95% ethanol 後，加 100ml 蒸餾水。
 
疫學調查
家禽霍亂為各種禽類高死亡率之急性傳染病。可發生於各種陸禽類（雞、火雞等）、水禽類（鴨、鵝等）及野鳥類。近年台灣地區之水禽類常有本病之流行，病原細菌 P. multocida 可感染任何年齡層的鳥類，引發出血性敗血症，流行初期，常發現禽隻無症狀突然死亡，死亡率很高，常致嚴重之經濟損失。在流行末期亦有慢性型病例。
 
臨床檢查
 
急性型病禽呈現高熱、沉鬱、食慾廢絕、垂翼、閉目、縮身、不願走動、口鼻流出黏液、呼吸加速、水樣惡臭下痢便
 
病理檢查
 
1. 病理剖檢：
鴨喙部呈現水泡，剛死時全身青紫。剖檢死亡的病禽，呈現出血性敗血症病變，包括被動性充血、出血、肝脾腫大且有局限性灰白色小壞死點、肺充出血、胸液與心包液略增，全身漿膜有纖維素滲出物。耐過急性期未死之病禽，肉垂、關節及足掌腫脹，消瘦，結膜炎。剖檢可見感染部位呈壞死與纖維素性化膿性病灶
2. 病理組織學檢查：
(1) 急性型：
(a) 急性型：
(b) 肝之壞死病灶俱炎症細胞之浸潤
(2) 慢性型：
(a) 頭蓋骨內有纖維素及炎症細胞組成之酪狀物，炎症細胞之死塊附近，常可見多核巨細胞。
(b) 局部感染病灶有時見於結合膜及其四周組織，使其臉部水腫，肱骨及各關節腫而有乾酪狀滲物。
 
細菌學檢查
 
1. 直接鏡檢：
血液或肝塗抹標本以methylene blue或Giemsa染色，可見多數兩端濃染之桿菌。
2. 分離培養：
P. multocida為兼性厭氧菌，在35-37℃時發育最佳，初代分離可用葡萄糖澱粉瓊脂基(Dextrose starch agar，DSA)、血液瓊脂基(Blood agar)或胰化酪蛋白瓊脂基(Trypticase soy agar，TSA)等培養基。培養18-24小時出現直徑1-3mm之菌落，菌落有特殊氣味，呈平滑、圓形飽滿、透明與螢光，有莢膜之菌株其菌落較無莢膜者為大。本菌以單個或成雙存在，呈球桿狀或短桿狀，大小0.2-0.4x0.6-2.5μm。初代新鮮分離菌或直接由組織塗抹菌，以 Wright 或 Giemsa 染色常呈兩端濃染現象。本病原菌極易由急性患禽之肝、骨髓、脾、或心血，或由慢性患禽之病灶或骨髓分離。污染之病材可先皮下注射小白鼠，經 24-48 小時後，由死亡之小白鼠之心血或肝再作分離培養。
3. 細菌鑑定：
本菌之鑑定主要以生化試驗，醣類發酵試驗最主要，會產生發酵之醣類包括葡萄糖、mannose、galactose、及蔗糖，不會發酵rhamnose、cellobiose、raffinose，inulin、erythritol、adonitol、m-inositol及 salicin，mannitol 通常會發酵，通常不會發酵 Arabinose malstose、lactose及dextrin，不一定會發酵者包括Xylose、trehalose、glycerol及 sorbitol，P. multocida 無運動性，大部份不會溶血。在 MacConkey瓊脂培養基不會發育。能產生 catalase、oxidase 及 ornithine- decarboxylase，但不產生 urease、lysine- decarboxylase、beta-galactosidase或 lysine-dehydrolase，phosphatase 之產生不確定，可還原nitrate，產生indol與H2S。methyl red與 Voges - Proskauer試驗均為陰性。P.multocida與其他菌種之Pasteurella spp.及Riemerella anatipestifer 之鑑別可參照表1所列之各種試驗。
4. 血清型別檢查：
P.multocida 之抗原分類可分為莢膜血清群與菌体血清型，莢膜血清群使用被動血球凝集試驗，目前分為A、B、D、E與F等5群，在鳥類除E群外均曾分離到。最近開發一種非血清學之平板擴散試驗，使用一種特異性粘液多醣酵素，可以區別A、D與F等血清群。菌体血清型之區分使用膠內免疫擴散反應(Agar Gel Immunodiffusion Test，AGID)，目前分為1--16型(Heddleston)，除第8及13型外，其他各型在鳥類宿主均己分離到。強病原性株之第 1、3 及 4 型具夾膜抗原為 A 群之主要部份。
(1) 膠內免疫擴散反應(Agar Gel Immunodiffusion Test)
(a) 把P.multocida塗佈於直徑 9㎝平皿之葡萄糖澱粉瓊脂基(Dextrose starch agar)培養18-24小時，使生成濃厚菌苔。
(b) 刮下菌苔，懸於1.0mL含0.3%福馬林之磷酸緩衝溶液(0.85% NaCl，0.02M phosphate，pH 7.0)。
(c) 菌液在沸水中加熱1小時。
(d) 離心1500相對離心力，30分鐘，取上清液即為抗原。
(e) 100mL 0.85%氯化鈉鹽水加0.9gm Noble瓊脂(Difco)，加熱溶解，每片標準玻片(25x75㎜)加4-5mL完全溶解瓊脂，冷卻，凝固。
(f) 在瓊脂上打孔徑3㎜之孔。
(g) 中央孔加入抗原液，周邊孔加入診斷抗血清，置於密閉潮濕盒內，37℃24小時。
(h) 細菌血清型之判定，可依抗原液與診斷抗血清之沉降線出現與否而定。
(2) 慢性型：
(a) 頭蓋骨內有纖維素及炎症細胞組成之酪狀物，炎症細胞之死塊附近，常可見多核巨細胞。
(b) 局部感染病灶有時見於結合膜及其四周組織，使其臉部水腫，肱骨及各關節腫而有乾酪狀滲物。
 
類似疾病鑑別診斷
 
新城雞病、沙門氏桿菌病、大腸桿菌病、鳥流行性感冒及披衣菌病等。

表1、Pasteurella multocida 與其他 Pasteurella spp.及Riemerella anatipestifer 之區別鑑定