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野外豬瘟病毒人工感染 SPF 豬之試驗

作者
李淑慧　鍾明華　林有良　黃天祥
建立日期
96年01月23日
更新日期
96年01月23日
內容
一、 病歷：
  　　5 週齡第二代 SPF 豬行鼻口腔內 (IN & IO) 接種 106.5 TCID50 之 94-4 株 PK-CL 細胞增殖第三代豬瘟病毒株，於感染後第六天予以剖檢之，試驗豬臨床上除體溫呈高熱 (41.1℃) 外，無明顯症狀。
  　　豬瘟病毒： 94-4 ，源自宜蘭縣轄養豬場，罹患豬瘟病例豬隻之肺臟乳劑，以 PK-CL 細胞分離所得。該場之疫情如下：
  　　 81 年宜蘭縣礁溪鄉某肉豬場，2 月齡豬隻，病發三天內皮膚呈紫斑及出血斑、發病五至六天部份豬隻陸續開始死亡。發病率為 136/1100，死亡率為 136/136。 該發病豬隻係自外購入，據查該場豬瘟免疫方式為哺乳前免疫，注射日期及疫苗批號皆不詳。購入後皆未再施行豬瘟補強注射。
   
二、 肉眼病變：
 

1.

 脾　　：輕度梗塞（圖 1）。

2.

 淋巴結：腸間淋巴呈輕度周邊出血灶。

3.

 腎　臟：腎臟散發點狀出血灶（圖 2）。
   
三、 組織病變：
 
1. 大　腦： 非化膿性腦炎不明顯，腦實質可見血管內皮細胞增生現象。
2. 脾　臟： 局部梗塞，血管內皮細胞增生，脾小結周圍成熟淋巴球顯著減少，而 改由網狀內皮細胞所取代（圖 3）。
3. 淋巴結： 成熟淋巴球顯著減少，髓質部可見小血栓形成。
   
四、 微生物檢驗：
 

1.

 細菌檢查：採取病豬之肺、肝、脾、腦及膽囊等臟器於 TSA、Mac Conkey 及 DHL 培養基中培養，結果皆為陰性。

2.

 血液檢查：
(1)血球計數：白血球總數為 9000 個 /mm3。
(2)血液抹片：Wright's stain 染色檢查，白血球呈核左轉現象。

3.

 病毒學檢查：
(1) 病毒分離：試驗豬隻之各組織臟器，以含有 2％ FCS 之 EMEM 培養液做成 X10 乳劑，將乳劑及血清接種 24 孔內之 PK-CL 細胞單層，在 36℃ 3％ CO2 暖箱內吸著 2～3 小時，經培養液洗滌一次後，加入內含 2％ FCS 之 EMEM 培養液。繼續培養三天後，以間接螢光（IFA）染色法判讀。
(2) PCR 診斷：
1. 引動子（Primers）：針對豬瘟病毒的臺灣分離株、LPC 疫苗株、Alfort 株及 Brescia 株之核酸序列，經比對後，取其完全相同部份的核酸序列，設計一對引動子，可檢測所有之豬瘟病毒。
並就比對後的核酸序列，於差異之鹼基數最多處，設計一對引動子， 是為 LPC 特異性引動子，僅能檢測 LPC 豬瘟疫苗株病毒。
2. 方法：
(1) 試材核酸之製備：各試材，分別取 0.2ml 置於 1.5ml 微量管中，再加入泰柔 RNA 萃取試劑 1ml，經震盪 30 秒後靜置於室溫中 5 分鐘，再加入 0.2ml 之氯仿，充分混和後於室溫中靜置 3 分鐘，再以 12,000rpm、4℃ 離心 15 分鐘，隨即取其上清液裝在另一支滅菌之微量管中，並加入等量的異丙醇，充分混合後再靜置於室溫中 10 分鐘，然後以上述條件離心 20 分鐘，去除上清液後再加入 0.1ml 絕對酒精，以同條件離心 5 分鐘，再去除上清液後以真空離心乾燥，再加入適量經 DEPC 處理過 之一次蒸餾水即完成核酸製備。
(2) 合成第一股 cDNA 及聚合脢鏈反應：將各試材之核酸溶液，分別裝於 0.5 毫升的微量管中，並加入 10ul 之 10 倍 DynaZyme 緩衝液（含 500mMKC1、100mMTris-HC1，15mMMgC12，0.1％Triton X-100）、0.02 微莫耳鹼基（dATP，dCTP，dGTP 及 dTTP 各為 1.25mM）、16 單位 RNasin 、 2.4 單位 AMV 反轉錄脢、 2 單位 DynaZyme 聚合脢及經 DEPC 處理過之二次蒸餾水，再加入0.01 nanomole 引動子。每管反應溶液之體積為 100 微升，混合圴勻後， 上面覆蓋適量之礦物油。整個反應是在熱循環器（Perkin Elmer Cetus DNA Thermal cycler）中進行，先以 42℃ 進行 40 分鐘之反轉錄作用，隨即進行 PCR 反應。
(3) 洋菜膠片電泳分析：分別取 10 微升（ul）PCR 產物與 1 微升（ul）的膠片載入緩衝液 （gel loading buffer）混合後，以 2％ 洋菜膠片電泳分析，此一膠片是以 TAE 緩衝液泡製而成，其中包含溴化醯液（ethidium br omide）每毫升 0.5 微克（ug），經 100 伏特電壓電泳 20 分鐘，以 DNA -100bp-Ladder 當作分子量標記。
3. 結果：豬體內各臟器，以 AHC3.4 引動子測試若為陽性反應者，均可產生 459 個鹼基對的產物；以 HCT31.32 引動子測試結果為陽性反應者，則可得到 439 個鹼基對的產生。
   
五、 診斷：
  豬瘟（Hog Cholera）
   
六、 討論：
 

1.

 本病例之發生可能原因：發病豬隻皆為自外購入者，且購入後未即時予補強注射，可能導至豬隻豬瘟抗體低下，而該豬場為一老舊豬場，豬舍設備及環境皆差，豬舍出入口亦無消毒槽之設施，出入人員管制鬆散，病原可能由此帶入，再加以抗體過低不 足以保護豬隻故而發病。
　　該病毒株以 PCR 技術偵測結果為野外病毒株，接種家兔亦無熱反應現象 ，經人工感染試驗結果，可初步得知本野外病毒株非屬強毒株及 LPC 疫苗株 。

2.

 PCD 6 剖檢腦組織病變不明顯，典型之豬瘟病變須待豬瘟病毒二次增殖，經病毒血症傳播至全身才能引發典型病變。本病毒株 94-4，經人工感染試驗其中一頭於 PCD 12 時剖檢可見典型非化膿性腦炎病變。

         圖1：5 週齡 SPF 豬，人工感染野外分離豬瘟病毒株（S94-4）第六天，豬隻食慾及精神皆無異狀，剖檢可見脾臟尾端有一 0.5cm 大小之紅色扇形梗塞區。      圖2：5 週齡 SPF 豬，人工感染野外分離豬瘟病毒（S94-4）第 11 天，豬隻臨床上皆屬正常，剖檢可見腎臟呈散發性點狀出血。

        圖3：5 週齡 SPF 豬，人工感染 S94-4 豬瘟病毒第 8 天，脾組織切片可見局部梗塞區、淋巴濾胞壞死、出血及血管壁之類纖維素變性。       圖4：5 週齡 SPF 豬，人工感染 S94-4 豬瘟病毒第 6 天腦組織切片，於腦實質血管可見明顯的內皮細胞之細胞核，內皮細胞之數量有輕微增加等病變。