口蹄疫
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口蹄疫 (Foot and mouth disease，FMD)
一、緒言
是一種極急性、高度傳染性疾病，感染對象為偶蹄類動物，以口、鼻、舌、趾、蹄冠、乳房及乳頭部皮膚產生水疱然後糜爛為其特徵。感染動物之產肉能力、產乳能力大幅下降，並會造成年幼動物之大量死亡。由於此病可藉接觸與空氣而傳播，可以說是世界上所有重要畜產國家高度嚴防的主要傳染性疾病，也是國際貿易中各國動物檢疫的首要傳染性疾病。國際畜疫會將之列為最重要的 15 種 A 表疾病之一 ，我國動物傳染病分類亦列為甲類疾病。 本病最早於 1514 年在義大利發生後，幾乎所有畜牧事業發達的地區均發生過。本省於日據時代 1913 年至 1916 年、1924 年至 1929 年前後發生兩次流行 ，經勵行發病場撲殺政策後撲滅。1997 年 3 月 20 日確診又再度入侵，經研判其原因可能為自疫區走私偶蹄類動物、屠體或人員參觀疫區養豬場而傳入。 口蹄疫是一種 RNA 病毒，由 Picornaviridae 之 Aphthovirus 引起，本病毒共有 7 種血清型，81 種以上之亞型，各血清型別間無交叉免疫保護效果，7 種血清型代表 7 種不同之口蹄疫。病毒直徑約 23 nm，表面共有 4 種主要的結構蛋白質：VP1、VP2、VP3、VP4，已知 VP1 能產生中和抗體。 本病毒一般不耐酸也不耐鹼，pH < 6 或 pH > 9 的環境足以殺死病毒。低溫可存活很久（攝氏零下可長達數年），溫度越高抵抗性越低。肉類加熱處理超過攝氏 80 度很快可以把病毒殺死。本病可由空氣傳播或直接與感染動物、病畜製品或污染物品接觸而感染。病毒在低壓低風速、高濕度、低溫度等有利情形配合下，可藉空氣傳播到數公里外使動物感染。人吸入口蹄疫病毒可在鼻或喉頭部位保毒 3～21 小時，並可藉此傳給其他具感受性動物。病毒可恢復牛之咽喉食道持續排毒 6～36 個 月，從羊之食道粘膜排毒約為 4～6 個月。國際畜疫會（Office International Des Epizooties，OIE）手冊中列有數種診斷方法，例如細胞接種分離病毒、酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA) 、反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、病毒中和試驗（VN）等，本標準為參酌 OIE 之方法所訂定適合吾國之診斷步驟。
二、臨床症狀與剖檢病變：
臨床症狀：
牛： 本病潛伏期 1～7 天。特徵為發熱、倦怠、食慾不振、流涎等症狀，伴隨著口腔形成水疱，破裂後形成糜爛。蹄部出現水疱時則有跛足現象。水疱同樣可發生在乳房皮膚。泌乳量減少，乳房炎和流產為一般症狀。水疱開始形成時如大頭針頭大小，然後可增大至核桃大或更大。水疱常發生融合，形成 瀰漫性損害。蹄部症狀常見于蹄冠和趾間，局部有熱感、發紅、微腫和疼痛 。經過 1～2 日，於上述蹄部無毛處出現小水疱並很快增大；初期充滿透明的 然後變為混濁的漿液，水疱破裂後形成爛斑。母牛，尤其在泌乳期，幾乎均 可在乳頭皮膚產生水疱，病毒在乳腺上皮增殖病牛於潛伏期和臨床症狀發生 期內可從乳汁中分離到病毒。口蹄疫病變也可見于鼻咽部、食道和瘤胃，有 時也見於母牛陰道粘膜及公牛陰囊。成年動物死亡率很少超過 5 %，幼年動物 則高達 50 %。但惡性口蹄疫也對成年動物具高度致死率。新生犢牛呈最急性經過而不形成水疱。病犢出現高熱、極度衰弱、心臟衰竭、常見下痢。經 1 至 2 日因心肌炎而死亡。
羊：
綿羊感染口蹄疫之潛伏期為 1～6 日，其症狀有時輕微至不被察覺，尤其 是水疱僅限於口腔粘膜時，由於水疱較小，有如米粒大，又無其他明顯之症 狀如流涎等，而且水疱迅即消失，因此不易被察覺。但如仔細檢查仍可見到 上唇發炎腫脹，有時頰部和咽部也發炎腫脹。 蹄部也和牛相同，於發生水疱時出現跛足現象，但水疱小得多，最後病 羊避免任何運動。發炎變化常漫延至蹄小囊，可從蹄小囊之輸出管擠出多量膿性乾酪樣團塊。個別病例的乳房上、陰唇上和陰道中也有小水疱，舌上也常見有小水疱。患病羊群如飼養環境良好、乾燥時，本病幾乎呈輕微與良性的經過。反 之，如飼養環境不良並常加驅趕時，則容易使病情惡化，如繼發感染則可引 起局部化膿、骨骼壞死、蹄脫落和敗血症。孕羊常流產。 山羊症狀與綿羊相同，但有時也可見到嚴重病例，部份伴有心臟病變。 在較劇烈的流行時，全身症狀如虛弱、高熱、食欲減退或廢絕、泌乳停止等 均較顯著還常出現唇部和面頰腫脹。伴有心臟病變的惡性病例或死於衰竭， 或無明顯症狀而突然死亡。 乳山羊感染口蹄疫常出現嚴重的典型口蹄疫症狀。
豬：
豬的症狀與牛相似，跛足為常見的症狀。潛伏期約 1～7 天，最短 12 小 時，最長 14 天。哺乳仔豬感染本病時突然整窩暴斃，死亡率可高達 100 %，仔 細檢查可在舌頭、牙齦、口蓋、趾間等處發現水疱。母豬感染時口、鼻、舌頭、牙齦、口蓋、乳房、乳頭、蹄冠部、趾間出現水疱，約 1～2 日水疱破裂，患部糜爛出血，蹄冠裂開，嚴重時蹄會脫落。發病期體溫上升（攝氏 40～ 41 度）、拒食、口中流涎含白色泡沫，懷孕母豬會發生流產，死亡率低。肉豬症狀與母豬相似，於口、鼻、蹄部出現水疱、蹄裂甚至掉蹄，發熱、拒食、流涎含白沫，死亡率約 5 %。
剖檢病變：
典型的水疱不一定可看到，不過一旦發生多經破裂而成糜爛、出血及肉芽腫狀的粘膜，這種病變在鼻、口腔、乳房或蹄等部位發生。解剖時也可見胃腸病變，特別在瘤胃，偶爾會陰、外陰及陰唇也會有病灶，幼年牛感染時可見虎斑心（灰、白或黃色的心肌病變）。豬感染本病時也可見氣管、支氣管、咽喉、食道、胃粘膜之潰瘍，大小 腸粘膜點狀出血，腸漿膜面出現水疱。心包膜點狀出血、心肌表面可見灰白 色或黃色條紋斑塊（虎斑心），心肌切面可見灰白色或黃色壞死區。虎斑心常見於暴斃之哺乳仔豬，偶見於急性死亡的肉豬。 口蹄疫水疱之大小差別甚大，依動物種類及其發生部位而定。最小的見于山羊如大頭針頭，而最大的則見于豬的鼻部與牛之舌頭。
三、實驗室診斷
本病在臨床上無法與豬水疱病 (swine vesicµlar disease）、水疱性口炎（vesicµlar stomatitis）及豬水疱疹（vesicµlar exanthema of swine）加以區別，必須進行實驗室確診。由於口蹄疫病毒之高度傳染性及空氣傳播之特性，其診斷實驗室必須是經中央主管機關指定的負壓隔離密閉之實驗室。位於英國坡布萊 (Pirbright) 經國際畜疫會認證之口蹄疫世界參考實驗室（WRL for FMD），接受世界各地送檢之疑似口蹄疫病材。該實驗室並對具有負壓隔離密閉之診斷實驗室提供口蹄疫 ELISA 診斷試劑。
病材之採取：
水疱液及水疱上皮之採取 供診斷用之病材以未破或剛破不久之水疱上皮最好（最少要採 1 gm）， 水疱液（最少 1 ml）也可。水疱上皮需置於 5 ml 可密封之塑膠無菌瓶，並加入輸送液 2 ml（甘油一份、0.04 M 磷酸緩衝溶液（PBS）一份，加入 500 IU / ml 青黴素、500 µg / ml 鏈黴素，並以 0.1 M NaOH 調整 pH 值至 pH 7.2～7.6） ，如無輸送液，可以細胞培養液或 PBS 代替。病材須馬上冷藏（8 ℃ 以下）， 並於 12 小時內連同病歷表送達前述之負壓隔離密閉診斷實驗室。 如果無法採到水疱上皮時，例如發病前、恢復期或是可疑患畜，則必須採取咽喉食道液（oesophageal-pharyngeal fluid； 簡稱 OP 液）。使用食道探子(probang) 採集，採取後，倒入 20 ml 廣口瓶，並檢查其內容，如混有反芻之食 物或血液則必須丟棄並重新採取，取 2 ml 與等量之輸送液（0.08 M PBS 含 0.01 % 牛血清白蛋白，0.002 % phenol red， 500 IU / ml 青黴素，500 µg / ml 鏈黴素，pH 7.2）混合，最終之 pH 須在 7.6 左右為佳。OP 液採取後必須馬上冷藏（8 ℃ 以下）或冷凍，如以乾冰冷凍須密封，以防止二氧化碳之滲入而使 酸度增加，因口蹄疫病毒對酸很敏感。
血液之採取：
以 10 ml 塑膠注射筒（不加抗凝劑）由頸靜脈採取 5 ml 的血液，裝於塑膠 無菌試管連同病歷表送檢，血液只可冷藏不可冷凍。
確診方法 ：
一是證明其抗原之存在，另一是證明其已產生抗體。
證明抗原
病毒分離 ：
收到病材時先於登記簿上登記，然後以試紙檢測其 pH 值並將其登記在登記簿上。無菌操作取出病材，滴除輸送液，稱重後以乳缽研磨再以 0.04 M PBS 製成 10 倍乳劑，1000 xg 離心 10 分鐘，取上清液保存於 4 ℃ 供病毒分離或 酵素結合免疫吸附試驗用，但不可超過二天，長期保存則保存於 －70 ℃。上述病材上清液或水疱液，接種於已形成單層細胞之初代牛甲狀腺細胞、初代牛、豬、小羊之腎臟細胞或是 BHK-21、IB-RS-2、ESK 等株化細胞。病毒量少時，初代細胞較株化細胞敏感。接種後觀察其有無細胞病變作用（CPE） 產生。產生 CPE 者以下述之酵素結合免疫吸附試驗，鑑定其是否為口蹄疫並鑑定其血清型別。
酵素結合免疫吸附試驗 ：
試劑由 Pirbright 的口蹄疫世界參考實驗室提供，可以用來檢測病材中之口蹄疫病毒並鑑定血清型別，目前由該實驗室所提供之試劑套組可以檢測鑑定的血清型包括 O、A、C 、Asia 1 以及 SVD。其方法為： 先將兔抗各種血清型 FMD 病毒及 SVD 病毒之血清溶於 coating buffer 後被覆於 96 孔 ELISA 免疫盤，每孔 50 µl，密封後置 37 ℃ 感作 1 小時，以 PBS 清洗 3 次，甩乾。加入病材乳劑 50 µl 以及陽性、陰性對照抗原各 50 µl。置 37 ℃ 感作 1 小時，感作後以 PBS 清洗 3 次，甩乾。 再加入天竺鼠抗各血清型 FMD 病毒及 SVD 病毒之血清各 50 µl，同樣置 37 ℃ 感作 1 小時，PBS 洗 3 次。 加入酵素連結之兔抗天竺鼠血清 50 µl，置 37 ℃ 感作 40 分鐘，以 PBS 充分清洗 3 次。 加入受質及呈色劑 50 µl，作用 15 分鐘，最後加入停止液 50 µl。
以 ELISA 判讀機判定，平均 OD 值扣除背景值後 大 於 0.1 者為陽性，接 近 0.1 者，須再重測或以細胞培養觀察其有無 CPE 產生。 証明抗體 檢測抗體可用中和抗體試驗及 ELISA 試驗。ELISA 試驗有較為敏感，可大量檢測，時間較短，不需細胞培養系統等優點。 中和抗體檢測 細胞可使用 BHK-21、IB-RS-2、小牛、小羊或豬之初代腎臟細胞。96 孔微 量培養盤，最低必需培養液（MEM）等為必需品。種毒（K4）先接種於已形成單 層細胞之仔倉鼠腎細胞株（BHK-21）等細胞，產生 CPE 後收集之，加入 50 % 甘油 。測定力價後，分裝保存於 －20 ℃，可維持約一年。血清 56 ℃ 30 分鐘不活化， 對照血清採取 21 天恢復期之豬血清。檢測中所有加的量以 50 µl 為準。 血清稀釋由 1 / 4 稀釋起，以 2 倍序列稀釋，每一稀釋做二重覆，每孔量 50 µl。 加入 100 TCID50 之病毒每孔 50 µl。
對照血清包括已知力價之陽性血清、陰性血清，尚須細胞對照，培養液對照，病毒對照。 蓋上蓋子置 37 ℃ 感作一小時。
加入 50 µl 之細胞懸浮液，其細胞數為 106 cells / ml。 48 小時後即可以有無 CPE 作判定，如要固定則等到第 3 天（以甲醇固定 2 分 鐘）。 1 / 45（含）以上為陽性，1 / 11（含）以下為陰性。
ELISA 抗體檢測：
先將兔抗各種血清型 FMD 病毒之血清溶於 coating buffer 後被覆於 96 孔 ELISA 盤每孔 50 µl，密封後置 4 ℃ 一夜。 血清與 coating buffer 之比為 1：1000，每一盤約需 6 ml（6 µl 兔抗 FMDV serotype 血清溶於 6 ml coating buffer)。測試血清與對照血清均稀釋 1 / 16，血清稀釋後各吸 50 µl 移入 96 孔 平底 微量 盤。然後加入口蹄疫抗原每孔 50 µl，與前面加的稀釋血清 50 µl 合計共100 µl ，輕敲盤角使抗原與血清充分混合，置 4 ℃ 一夜。
血清稀釋：
搖盪測試血清及對照血清使均勻，測試血清與對照血清均稀釋 1 / 16。（對照血清 C++、C+、C- 為 15 µl 之對照牛血清加入 225 µl 的 diluent buffer A 中，測試血清則為 10 µl 加入 150 µl diluent buffer A 中，C++、C+ 為各型陽性血清）。血清稀釋後各吸 50 µl 移入 96 孔平底微量盤中並另取紙張將血清位置加以標記。
清 洗：
將前一日被覆之 96 孔 ELISA 盤反轉過來甩掉內容物，須將它甩至容器槽，再以不起毛球之吸水紙瀝除餘液，以清洗液將每個小孔注滿後，再將清洗液甩掉，以吸水紙瀝淨，共重覆清洗三次。清洗時不得讓 96 孔 ELISA 盤之各孔乾凅。 將血清抗原混合液轉置至 ELISA 盤，置 37 ℃ 感作 1 小時。 在完成三次清洗並確定沒有殘餘液體留在盤中，取 50 µl 量的血清抗原混 合液，注入 96 孔 ELISA 盤中的相對位置，其盤子標記需與液相時相同。轉置時 對每個 Sample 要用新的滴頭。 接著把 96 孔 ELISA 盤封蓋起來，置於 37 ℃ 恆溫箱內的平台搖擺機上，持續 搖擺感作 1 小時（搖擺頻率每分鐘 120 次）。
注意：
所用的平台搖擺機，要有效的完全混合，且不得將內容物濺出。 若沒有平台搖擺機時，可用手打方式，輕敲盤子四周，以使反應 物均勻混合。
如 96 孔 ELISA 盤在恆溫箱中的搖擺機上需重疊時，則僅蓋上最上 面的一盤，而此種情形可能造成熱差度效應及蒸氣，最好不要重疊。 利用此一小時配製稀釋緩衝液 B 以供下一步驟用。
稀釋緩衝液 B 的製備：
0.01 M 磷酸緩衝生理鹽水 pH 7.2～7.6 加入 0.05 % 之 Tween 20，再加入 5 % 脫脂 奶粉。在測試當天，計算緩衝液 B 所需的量，並由相等量的稀釋緩液 A，加入最終濃度為 5 % 的脫脂奶粉製備而成。例如：製備 100 ml 的稀釋緩衝液 B，只需將 5 g 的脫脂奶粉加入 100 ml 的稀釋緩衝液 A 即得。調整 pH 值至 7.2～7.6 之間（以 0.1 M NaOH 調整）。
加入稀釋 100 倍之天竺鼠抗 FMDV 各血清型抗體每孔 50 µl，置 37 ℃ 感作 1 小 時。 在血清抗原混合液感作終止之前，要先以稀釋緩衝液 B，將保存的同源偵 測抗體（天竺鼠抗 FMDV 各血清型抗體）稀釋 100 倍，其體積量要足夠所使用的 96 孔 ELISA 盤數，（每盤以 6 ml 計，以 0.06 ml 的天竺鼠抗血清加入 6 ml 的稀釋 緩衝液 B 中）。將剩下的偵測抗體立即放回 4 ℃ 保存。
注意：
從盤子中倒出的內容液及清洗液，必須倒入含 0.2 % 枸椽酸消毒液的桶或槽中消毒，而碰到盤中試藥的可丟棄式滴頭，也要以此法消毒。
操作方法：
感作 1 小時後，從培養箱中取出 96 孔 ELISA 盤，依先前方法，以 清洗緩衝液清洗 96 孔 ELISA 盤，在清洗後馬上加 50 µl 量的 100 倍稀釋偵測抗體，於 96 孔 ELISA 盤的每孔中，再輕輕拍打 96 孔 ELISA 盤四周確定偵測抗體均已完 全分佈於每孔底部，再將 96 孔 ELISA 盤封蓋後置於 37 ℃ 恆溫箱的搖擺機上，持 續搖擺 1 小時。 加入酵素連結之兔抗天竺鼠血清每孔 50 µl，置 37 ℃ 感作 1 小時。在偵測抗體感作終止之前，馬上以稀釋緩衝液 B，將酵素連結之兔抗天竺鼠血清稀釋 200 倍，其量要足夠所用於檢測的 96 孔 ELISA 盤（每盤以 6 ml 計算，將保存的酵素連結兔抗天竺鼠血清 30 µl 加入 6 ml 的稀釋緩衝液 B 中）。剩下的酵素連結兔抗天竺鼠血清立即放回 －20 ℃ 保存。
操作方法：
感作 1 小時後從恆溫箱中取出 96 孔 ELISA 盤，以上述方法用清洗緩衝液清洗 3 次，洗後每孔立即加入 50 µl 之 200 倍稀釋酵素連結兔抗天竺鼠血清，並輕拍盤子四周，確定酵素連結兔抗天竺鼠血清，都完全落於每孔之底部。再將盤子封蓋後置於 37 ℃ 恆溫箱中搖擺感作 1 小時。
用剩之酵素連結兔抗天竺鼠血清液不要倒掉，受質 / 呈色劑製備液也不要丟棄，因這些剩餘試液在出現問題時，將可用來檢查酵素及受質的活性。
加入受質 / 呈色劑每孔 50 µl，置室溫 15 分鐘。在酵素連結兔抗天竺鼠血清感作終止之前，須先準備受質 / 呈色劑溶液，其量要足夠所檢測的盤數（例如：1 盤需取 30 µl 的受質 H2O2 加入 6 ml 的 OPD 中），OPD 的濃度為 3.3 mM， H2O2 是 4.4 mM。最後的受質 / 呈色劑溶液必須是無色的，且需存放於暗處，如有色澤呈現，則必須丟棄。 取一塊乾淨沒有被覆抗體的 96 孔 ELISA 盤，以之當作 ELISA 判讀機判讀時的背景盤（此盤用完後可清洗，並可留作往後測試時的背景盤用）。
操作方法：
於酵素連結兔抗天竺鼠血清感作 1 小時後，以前述方法清洗 96 孔 ELISA 盤，要確定所有孔洞均完全被清洗緩衝液沖洗，以清除無反應之酵素連結兔抗天竺鼠血清。清洗完成立即加入受質 / 呈色劑每孔 50 µl，由空白對照盤開始，於加第一 孔時即開始計時，置室溫 15 分鐘。 15 分鐘後由空白對照盤開始加停止液，每孔 50 µl，置搖擺機使混合均勻。 置 ELISA 判讀機以波長 A492 讀取其 OD 值及計算其 PI 值，PI 值大於 50 為陽性。
四、參考文獻：
Office International Des Epizooties (1996). Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Third edition. Paris, France. Ferris N. P. (1996). Indirect Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Detection of Antibodies of Foot-and-Mouth Disease Virus. Bench Protocol, World and E. E. C. Reference Laboratory for Foot & Mouth Disease. Pirbright, U. K.
附錄一：
各種試劑配製方法
一、 0.01 M PBS 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 1000 ml 中 pH 7.4 ±0.20 標貼後存於 4 ℃，不可超過二週。 二、 0.04 M PBS .BPR 5K 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 250 ml 中 pH 7.4 ± 0.20 標貼後保存於 4 ℃，不可超過二週。
三、 0.08 M PBS 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 125 ml 中 pH 7.4 ± 0.20 標貼後保存於 4 ℃，不可超過二週 。
四、 0.1 M NaOH 取 NaOH 0.4 gm 溶於滅菌過之蒸餾水 100 ml 中 以塑膠瓶盛裝 標貼後保存於室溫。
五、 細胞培養液 MEM (GIBCO) 1900 ml 胎牛血清 100 ml 青黴素 100 IU/ml 鏈黴素 100 µg/ml Fungizone250 µg / ml 標貼後保存於 4 ℃，不可超過四週 。
六、 稀釋液 A (Diluent Buffer A) 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 1000 ml 中 加入 0.5 ml 之 Tween 20 pH 7.4 ＋ / － 0.20 標貼後保存於 4 ℃，不可超過二週。
七、 稀釋液 B (Diluent Buffer B) 取 PBS 粉末一瓶 (sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 1000 ml 中 加入 0.5 ml 之 Tween 20 加入 5 % (W / V) 脫脂奶粉（Marvel，Chivers & Sons Ltd.） pH 7.4 ± 0.20 當天配製。
八、 清洗液 (0.002 M PBS) 取 PBS 粉末一瓶 (Sigma 編號 P-8033) 溶於滅菌過之蒸餾水 5000 ml 中 pH 7.4 ± 0.20 標貼後保存於室溫，不可超過二週。
九、 消毒液 0.2 % Citric acid (W / V) . BPR 5K 取 2 gms 枸椽酸溶於 1000 ml 水中標貼後保存於室溫。
十、 Chromogen Buffer 0.05 M phosphate-citrate buffer, pH 5.0 取 phosphate-citrate buffer 一錠 (Sigma P-4809) 溶於 100 ml 蒸餾水中 pH 5.0 標貼後保存於 4 ℃，不可超過一週。
十一、 Chromogen stock 3.3 mM OPD 取 Ortho-Phenylenediamine (OPD) 一錠 (Sigma P-8412) 溶於 50 ml Chromogen Buffer pH 5.0 中 標貼後保存於室溫黑暗處。 十二、 停止液 (1.25 M Sµl phuric Acid )：慢慢的將 68 ml 濃鹽酸 (18 M) 加入 932 ml 之蒸餾水中 標貼後保存於室溫 。