摘    要

牛接觸傳染性胸膜性肺炎 (CBPP) 是由絲狀黴漿菌 (Mycoplasma mycoides) 亞種 mycoides SC ( 牛同型小種 ) ( SC： 小菌落) 所引起的牛之疾病。它的症狀是厭食、發燒和呼吸困難、氣喘、咳嗽和鼻分泌物增加等呼吸道症狀。診斷的方法是靠分離出病原菌。疫情控制和疾病根絕上最大的問題是經常有亞急性或無症狀的感染，以及在臨床感染後成為持續慢性帶原者。

病原菌的鑑別：由活體動物採集的樣本是鼻拭物和/或支氣管肺泡洗出物或穿刺取得的胸膜液。由屍體解剖取得的樣本是病變的肺、淋巴結、胸膜液和患關節炎動物的關節滑液。也可以直接檢查滲出液或做抹片檢查，但它需要有很好的技術。

病原菌的培養是將組織磨碎加入抗生素置於含抑制雜菌的培養基內一起培養以防止雜菌的生長。當這黴漿菌亞種培養數天的期間必須將培養皿蓋緊或用有濕度控制的保溫箱以避免固體的培養基過於乾燥。

在肉湯培養基裡培養 3 ~ 10 天之後，當搖動時可看到一均勻渦漩雲霧狀生長帶。在瓊脂培養基裡則發展成直徑1毫米的小菌落，呈現一種典型的 “煎蛋” (fried egg) 狀外觀。它的生物化學特性是：對洋地黃皂甘 (digitonin) 有敏感性、可還原四唑鹽化物 (tetrazolium salts) 、可分解葡萄醣、無精胺酸水解作用並且缺乏磷酸酵素和分解朊的活性。它必須用特殊培養基來進行這生化特性的檢查。它可藉免疫反應試驗例如生長抑制試驗和免疫螢光抗體反應試驗 (兩者都使用高免疫血清) 來確診。

血清學試驗：目前診斷上仍以改良Campbell & Turner 的補體結合試驗最為可靠並且在目前仍被推薦使用。但是，它的敏感性和特異性仍受到很大的限制。酵素結合免疫吸附試驗 (enzyme-linked immunosorbent assay) 和被動血球凝集試驗 (passive haemagglutination test) 可以用來做為篩選試驗。凝集試驗 agglutination test) 可以做為群體最近感染的診斷試驗。

疫苗和生物診斷製劑：T₁-44 減毒菌株現在被推薦用來製造疫苗。每劑疫苗活體黴漿菌的最低推薦力價是 10⁷ 補體結合單位。抗-鏈黴素減毒菌株 T₁-44 被發展做為牛瘟 / CBPP 混合疫苗之用。

A.   診 斷 技 術

牛接觸傳染性胸膜性肺炎 (CBPP) 是由絲狀黴漿菌 (Mycoplasma mycoides) 亞種 mycoides SC ( 同型小種 )( SC： 小菌落)所引起的牛之傳染性疾病。所謂的絲狀黴漿菌族是由 mycoides 菌族、capricolum 菌族和 Leach’s第七菌族所組成，它總共含有源自牛和山羊的六種黴漿菌 (6) 。這六種黴漿菌有共通的血清學和遺傳學上特性，因此會造成分類和診斷上的困難 (6，22) 。在自然環境下絲狀黴漿菌亞種 mycoides SC(MmmSC) 祗感染牛屬 (Bos) 的反芻類動物。MmmSC (牛同型小種) 曾在義大利的水牛裡被分離出來 (23)。在野生動物中祗有美國水牛 (北美野牛，Bison bison) 有感受性，而非洲水牛 (Syncerus caffer) 或其它野生反芻動物則無。它的症狀是厭食、發燒和呼吸困難、氣喘、咳嗽和鼻分泌物增加等呼吸道症狀。但臨床症狀並非唯一感染的證據，因為經常有亞急性或無症狀的感染。

　1. 病原菌的鑑別

致病的病原菌可以從感染的動物活體或在屍體解剖時所採集的樣本中分離出來。由動物活體採集的樣本是鼻拭物或鼻分泌物、支氣管肺泡灌洗液或經氣管的洗出物、在下胸腔第 7 和 8 肋骨間經由無菌穿刺取得的胸膜液，也可以做血液培養 (13)。由屍體解剖取得的樣本是病變的肺、胸膜液 (淋巴)、支氣管肺的淋巴結和患關節炎動物的關節滑液。

視病變的不同感染的病原菌有很大的變化，診斷結果為陰性並不能證明未受感染。

當病材送到實驗室時最好保存在輸送液中(無蛋白腖和葡萄糖的心臟浸出液，10% 酵母萃取物、20% 血清、0.3% 瓊脂、500 國際單位 (IU)/ 毫升的青黴素、1/7,000 的醋酸亞鉈)以利黴漿菌的保存和避免雜菌的增生。

如果需要貯存數天時，樣本必須存放在 4℃；如果需要貯存更長的時間則必須放置於 -25℃ 之下。肺切片或胸膜液的冷凍乾燥物也可以做為試驗室診斷之用。如果樣本無法在收集當天做處理時必須置於冷凍保存。

(a) 培養

祗要使用適當的培養基，MmmSC 並不難培養 (18)。培養基內必須含一些基本的介質（例如心臟浸出液或蛋白腖）、酵母萃取物（最好是新鮮的）和馬血清 (10%)。另外可以加其它許多成份例如葡萄糖、甘油、去氧核醣核酸、L - 半胱胺酸和脂肪酸，但它的效果視菌株而有所不同。為了避免雜菌的生長必須使用例如青黴素、黏桿菌素或醋酸亞鉈等抑菌劑。培養時可用肉汁或 1.0 ~ 1.2% 瓊脂的固體培養基。

肺切片樣本在磨碎後，加入混合有抗生素的肉汁培養基做 10 倍稀釋以防雜菌污染，然後再接種於 5 支試管和瓊脂上。胸膜液則可不經過稀釋直接培養。為了避免培養基過度乾燥必須將培養皿蓋緊或用有濕度控制的保溫箱但不需要使用二氧化碳培養。接種後的試管和培養皿必須連續觀察 10 天。通常肉汁培養基在 3 ~ 5 天之後會出現均勻的菌落，它呈現脆弱細絲狀稱為  ”慧星”的 MmmSC 特徵性菌落 (或亞種羊肺炎蕈樣黴漿菌，造成羊接觸傳染性胸膜性肺炎) 。之後幾天，在搖動時會呈現均勻不透明渦漩狀。瓊脂培養基的菌落則很小 (直徑1毫米) 並且有典型中間密度較大的 “煎蛋”形外觀。這時即可用 May-Grunwald-Giemsa 染色法、Dienes 染色法或間接螢光抗體試驗 (IFA) 來觀察。

(b) 生物化學試驗

在經過 2 ~ 3 次的繼代培養 (subculture) 之後，不再加抗生素以便瞭解此分離物是黴漿菌或是L - 型桿菌，因沒有抑制劑時它會恢復原來在培養基中生長的形狀。一旦做了以上的測試並在調菌 (至少需選擇 3 個菌落) 之後便可用來做生物化學的鑑定 (1)。

MmmSC 對洋地黃皂甘敏感 (和其它黴漿菌目相同) 、不會產生 “薄膜和斑點”、分解葡萄糖、還原四唑鹽化物 (好氧或厭氧) 、不水解精氨酸、沒有磷酸酵素的活性和沒有或祗有微弱的解朊特性。

針對這些試驗而發展出的一些特殊培養基含有同樣的基本成份 (心臟浸出液、馬血清、25% 酵素萃取物和 0.2%去氧核醣核酸溶液)，另外做葡萄糖水解試驗時加 1% 的 50% 葡萄糖溶液，做精氨酸水解試驗時加 4% 的 38% 精氨酸鹽酸溶液以及做還原四唑鹽化物試驗時則加 1% 的 2% 三苯基四唑化氯溶液 (triphenyl tetrazolium chloride solution) 。為了顯示解朊作用所以用酪蛋白瓊脂培養基 (casein agar) 和 / 或凝固血清瓊脂 (coagulated serum agar)。

一旦做完生物化學檢查，則必須再進一步用以下的免疫學試驗來鑑別確定：生長抑制試驗 (GIT) 、螢光抗體試驗 (FAT) 和薄膜過濾的小斑免疫結合 (MF-dot) 試驗。

一般來說，祗要有適當的方法和培養基時，做牛接觸傳染性胸膜性肺炎病原菌的分離和鑑別並不是一件很困難的工作。如果可能的話，也可用傳統的細菌實驗室騰出一部份專做為黴漿菌處理之用。

(c)  免疫反應試驗

病原菌或它的抗原可以用免疫化學試驗，由感染的組織、器官粘液和/或培養皿中檢測出來。但因為一部份的試驗需要有最低的病原菌量存在於樣本中才能被檢測出來，所以祗有陽性結果才具有參考價值。

(d)  核酸確認的方法

用放射性同位素標定或用酵素來探測的方法已經頗為流行，但因它們仍有許多缺點因而在使用上受到了限制。換句話說，最近發展出的聚合酶鏈反應 (PCR) 具有非常高的特異性、迅速和簡單易操作，特別適合絲狀黴漿菌叢 (25) 和MmmSC (7)診斷用 (2,7)。使用例如肺滲出物的樣本時，聚合酶鏈反應可以直接應用在經過沸水變性之後，而不需萃取出去氧核醣核酸。它甚至可以用在過濾紙上的乾燥樣本。肺碎片必須先磨碎，並經過低速離心之後再變性和做聚合酶鏈反應。聚合酶鏈反應也可應用於尿或血液。聚合酶鏈反應的最大好處，是它可以應用於保存不良的樣本（被污染或是可能經過抗生素的處理過程黴漿菌已經沒有活力）。

　2. 血清學反應試驗

(a) 補體結合試驗（國際貿易組織指定的試驗）

Campbell & Turner補體結合試驗 (CF) 至今仍被推薦使用 (雖然現在使用的方法和原來的有些不同)，許多國家當此疾病爆發時仍廣泛使用這個方法(19)。補體結合試驗是一種微量方法，它已被歐洲聯盟一致所接受 (11) 。為了做抗原的力價測定和達到一致性的目的，標準的陽性血清已經製備完成 (分別是840 和 845，PS₁ 和 PS₂)，它可由葡萄牙里斯本的獸醫調查實驗室取得 (11)。但是，補體結合試驗在操作上仍是非常困難，因此必須由非常有經驗的研究人員來操作。

˙反應劑

(1) 佛羅拿緩衝液 (VB)，pH 7.3。是一濃縮的儲備溶液，使用時用滅菌的二次蒸餾水 (double-distilled water) 稀釋 5 倍。

(2) 血清樣本，不含紅血球，必須在 56℃，30 分鐘之下使之不活化，使用時用佛羅拿緩衝液稀釋 10 倍。

(3) 抗原是 MmmSC 的懸浮液，必須事先經過力價測定，使用劑量為 2 補體結合單位 (CF unit) 。它必須貯存在 4℃，沒有冷凍的狀況之下。它必須由國際認可的實驗室來生產、測試和運送。

(4) 補體 (C’) 是天竺鼠的正常血清。它是經冷凍乾燥之後再以滅菌的二次蒸餾水溶解。在溶解之後必須貯存在 -20℃ 之下。

(5) 溶血素 (haemolysin) 是兔子對羊紅血球 (SRBC) 的高度免疫血清。使用劑量是 12 HD₅₀。

(6) 羊紅血球是由頸靜脈無菌穿刺採血而得。它們可以用阿爾佛氏溶液或檸檬酸鈉來保存。使用時製備成 6% 的懸浮液。

(7) 溶血系統 (HS) 的製備是以溶血素 12HD₅₀ 稀釋於佛羅拿緩衝液中再加入等量的 6% 羊紅血球懸浮液而得。此系統可在 37℃ 水浴中間歇振盪 30 分鐘而使之活化。

(8) 兩個陽性標準血清 PS₁ 和 PS₂ 是由自然感染的動物採集而得的牛血清，其分別是低和高力價。並做為補體結合試驗時的均質化、對照和抗原滴定之用 (PS₂) 。它對布氏桿菌、副結核分枝桿菌、披衣菌、考克斯氏體、螺旋體、牛傳染性鼻氣管炎、傳染性膿疱陰道炎和牛白血病病毒抗體等呈陰性反應。

(9) 陰性對照血清 (NS) 是採自健康牛的血清，它對以上的細菌均呈陰性反應。

˙試驗步驟

(1) 準備 25μl 的測試血清樣本，加入 25μl 的2補體結合單位 (CF unit) 之抗原。

(2) 加入 25μl 劑量為 2.5 單位的補體 (C’) 。搖動並培養於 37℃ ，間歇振盪 30 分鐘。

(3) 加入 25μl 的溶血系統 (HS)。搖動並培養於 37℃，間歇振盪 30 分鐘。

必須設定下列的對照組：

補體：0.5 單位，1 單位和 2.5 單位。

溶血系統：75μl 的佛羅那緩衝液 + 25μl 的溶血系統。

抗原：25μl 的 2 補體結合單位抗原 + 25μl 的 2.5 單位補體 (C’)+25μl 的溶血系統。

注意：微量培養盤在培養期間，必須搖動兩次。每一個微量培養盤或是每一批的試驗反應都必須有以上所提及的對照組即陽性血清 (PS) 和陰性血清 (NS)。

(4) 結果的判讀和解釋：在微量培養盤用 125g 離心 2 分鐘之後，以固定補體的百分比為基礎來判讀。

　陽性反應： 在稀釋 1/10 時呈 ++++

　可疑結果： 在稀釋 1/10 時呈 +，++，+++

如果在稀釋1/10時被固定的補體呈現陽性反應，甚至祗有部份陽性(+，++，+++)時必須再做進一步的調查確定。

補體結合試驗所受的限制已經非常清礎。在急性感染的動物補體結合試驗的診斷準確率幾乎可達 99.5%，但一小部份在疾病的早期或是慢性感染的動物則無法診斷出來。另外，如果使用治療葯物或是不恰當的預防措施(部份屠宰) 可能會增加假陰性的反應產生。但是以動物群體 (整群或流行病學單位) 來看則補體結合試驗可以 100% 診斷出這群動物是否已受到了感染。

以疾病的病因學來看，在潛伏期時補體結合試驗無法檢測出抗體的存在，這期間可能達數個月之久。

儘管補體結合試驗具有很高的特異性，但仍可能發生假陽性的結果 (低於 0.5%) ，它主要的原因是和其它的黴漿菌，特別是其它的覃樣黴漿菌族產生血清學上的免疫交叉反應。

試驗結果的準確性必須以死後和細菌學上的檢查以及在屠殺時採集的血液做血清學試驗來做進一步的確認。

(b) 其它試驗

目前已經有製備單株的抗體，並且也已經開發出ELISA診斷試劑 (4，13 ~ 15)。OIE Colloborating 中心的國際畜疫會參考實驗室 (FAO/IAEA, 澳洲) 動物疾病診斷的方法和應用已經發展出可應用的競爭性ELISA (參考第 707 ~ 721 頁的表)。

被動性血球凝集試驗 (5，20) 由於有相當高的敏感度，所以可以被用來做為篩選試驗。

發展出的田間快速玻片凝集試驗 (rapid field slide agglutination test) 可以用全血或血清 (27) 檢測出特異性的凝集素 (agglutinins) 。它的抗原是高濃度的黴漿菌懸浮液，用它和一滴的全血或血清混合。因為它的敏感度不高，所以祗用在感染疾病早期的動物，也因此祗能用於整群動物的診斷。

近來由 Western blotting 發展出來的免疫酵素試驗 (immunoenzimatic test) 因為具有高的特異性，所以被認為有診斷上的價值(21)。在實驗和自然感染的牛呈現出髓狀輪廓 (core profile) 時，則被視為具有免疫顯性 (immunodominant) 。如果想要用這試驗對感染動物有更正確免疫狀態的瞭解，則需要在電泳法中更深入分析宿主對 MmmSC 抗原的免疫反應。本試驗可克服有關非特異性抗原結合的困擾。

B.  疫苗和診斷用生物製劑之必要條件

自從 20 世紀以來已有許多疫苗被提及 (亦即死毒疫苗和異種疫苗) ，但沒有一種疫苗被證實有滿意的效果。目前，唯一經常被使用的是由減毒 MmmSC 菌株所製造的疫苗。

1. 種菌的處理

(a) 種菌的特性

祗有一菌株被使用來製備牛接觸傳染性胸膜性肺炎 (CBPP) 疫苗：T₁/44 菌株是1951 年被 Sheriff & Piercy 在坦尚尼亞所分離出來的野外菌株。經過第 44 代蛋繼代的馴化過程之後，可以保護牛不受疫苗注射後造成嚴重反應的影響。它的抗-鏈黴素變異株 T₁/SR 也可用於製造疫苗之用。

這疫苗菌株是以冷凍乾燥的方式保存在 -20℃。

(b) 培養方法

源自於疫苗培養方法的冷凍乾燥種菌群 (freeze-dried seed lots) 被用來做為製造疫苗，這些種菌菌群是保存在 -20℃ 之下。

可用 Gourlay’s 培養基或 F₆₆ 培養基做為種菌的培養：它們含有同樣的基本組成份，但 F₆₆ 培養基則比較複雜些 (18)。它們都經過過濾及蒸餾，並且保持在 pH7.8 ~ 8.0 之間。此培養基在製備好之後幾天內必須使用。成品必須均勻散佈在試管中並且在 37℃ 之下培養 48 小時以便檢查是否有雜菌污染。

每一菌種群被接種於試管內 (用 10 倍稀釋)。

(c)    合格的疫苗

T₁-SR 菌株可以被用來製造混合疫苗 (亦即牛接觸傳染性胸膜性肺炎和牛瘟疫苗)。

2. 製造方法

用來製造疫苗的培養基如 Gourlay’s 培養基或 F₆₆ 培養基已述於以上第 B.1.b 節。它們分別置於 1 公升燒瓶 (每瓶放 500 毫升) 和10 公升燒瓶 ( 每瓶放5 公升)，在使用前並置於 37℃ 保溫箱 48 小時，以便檢查是否有雜菌污染。

為了達到最高的細菌培養量，培養基的收成是在生長對數期 (logarithmic growth phase) 的末期及成長尖峰之前，因為在這階段之後有活力的黴漿菌數目會大量地減少。因此，在每個製造實驗室必須畫它的動力成長曲線 (kinetic curve) 。所使用的種菌株做 10 倍稀釋之後接種到試管內。為避免種菌純系化 (cloning) ，所以用稀釋倍數最高的試管當其達到生長指數期 (exponential growth phase) 時，即用來接種於 1-公升的燒瓶中 (1/10 倍稀釋) ，在培養 48 小時之後，再將這 1- 公升燒瓶內的菌種以高密度接種到 10-公升的燒瓶中 (10 毫升 1-公升培養液/每公升 10-公升燒瓶)，並置於 37℃ 的保溫箱中培養。在培養 24 小時之後，最好用電磁棒輕微攪拌。在達到生長的高峰時，（約在培養後 60 到 70 小時之間）將培養進行冷凍乾燥。

下列的步驟必須在溶冰之下進行操作：

˙ 加入冷凍乾燥保護的培養基內：脫脂牛奶 (4.5%，即每 5 公升水加 225 公克奶粉)。

˙ 分散置於試管中 (放置的容量視每個試管所需使用的劑量和所使用的低壓冷凍乾燥法而定)。

建議使用盤架式冷凍乾燥器來進行冷凍乾燥，如此可易於控制和監視每個不同的步驟。為了避免滲漏，在冷凍乾燥的機器裡時試管必須加以密封。

3. 製程中的控制

每個培養階段必須用格蘭氏染色，在顯微鏡底下檢查肉汁或血液瓊脂玻璃盤培養的肉汁是否有受到其它雜菌的污染。

收成的培養基則必須用相對比顯微鏡 (phase-contrast microscope) 來做快速檢查MmmSC 菌體是否存在，用標示的高度免疫抗血清做螢光抗體試驗或在試管內做界面沉降試驗 (interfacial precipitation test)。

冷凍乾燥疫苗的成品再接種到黴漿菌瓊脂或肉汁培養基，來進行生長抑制試驗 (GIT)。

4. 每批成品的控制

(a) 滅菌

細菌培養的肉汁和血液瓊脂一起置於 37℃ 培養。所有的培養基必須保持無菌狀態 (18)。檢測是否無菌，可以參考第 1.4 章。

(b) 力價測定

每劑疫苗的最低劑量是 10⁷ 補體結合單位 (CF units) ，但建議可以更高一點。冷凍乾燥疫苗在回甦（recovery）後必須再做一次力價測定，並做為疫苗注射之用。每一批的製造必須做力價測定試驗。

傳統技術：Gourlay’s 培養基是用 10 倍稀釋法。如果使用攪拌器 (漩渦型可以使試管內的懸浮液得到很好的均質化效果。第一，將試管內 5 毫升的懸浮液做 10^-6 到 10^-12 倍稀釋後再接種到 5 支試管裡培養 (每支試管內含 1 毫升，每個稀釋倍數接種 5 支試管)。所有接種後的試管放入 37℃ 保溫箱培養 4 天後再由指示劑的顏色變化來觀察生長的情形。滴定的方法是用 MacCrady’s 的 ”最可能數目”表或是用 Reed & Muench 方法。這方法簡單而且容易操作，但是缺乏準確度 (±0.5 log)。

微量滴定法 (microtitration) 可以得到更精確的結果 (24)，如果需要時可以使用這個方法。

(c)  安全試驗

當疫苗回甦之後各分別以皮下及腹腔接種兩隻小白鼠和腹腔接種兩隻雄的天竺鼠。接種數個月後沒有動物死亡，而且天竺鼠沒有睪丸炎的症狀。牛科或瘤牛動物上做過安全試驗，它們各別接種 10 倍劑量的疫苗然後觀察4週是否有不良應發生。

(d)  效力試驗

選定至少十隻牛皮下注射 1 劑量的疫苗，另外至少有十隻相同狀況的牛不注射疫苗作為對照組。在兩個月之後，所有的試驗牛被放在試驗感染的牛欄裡一起飼養，飼養的空間儘量小到可以很容易就互相接觸，並且每三隻試驗牛至少要有一隻感染牛。這些牛被放在一起飼養三個月後，所有的牛在屠宰後做死後的屍體檢查。接種過的牛必須不能出現或祗有輕微的臨床症狀，而且死後的病理檢查不能有胸膜炎的病變發生。80% 的對照組必須在死後的病理檢查出現典型的病變。

(e)  免疫期效

T₁/44 菌株和它的抗-鏈黴素變異菌株 T₁-SR 大約可以維持 1 年的免疫力(13)。

(f)   穩定性

冷凍乾燥的疫苗如果保存在 -20℃ 的溫度之下時至少可保存一年的時間(18)。

(g)  保存的方法

在低壓冷凍乾燥法時加入乾燥的脫脂奶粉（45 公克/每公升培養基）。冷凍乾燥疫苗回甦時則在室溫之下加入 1M 的硫酸鎂溶液 (每公升加入148 公克)。這硫酸鎂溶液可防止黴漿菌因熱而不活化（19）。

(h)  注意事項 (可能的危險)

現場的使用方法和冷凍乾燥疫苗回甦的方法，請參考 Provost 等人的報告 (18)。

敏感性較高的牛種在使用疫苗之前，必須先選擇一部份牛做疫苗測試(18)，它可能會產生嚴重的局部反應，但並不會妨礙疫苗的使用。

不論疫苗注射後的反應情形是如何，黴漿菌均會短暫地出現在疫苗注射後的牛血液裡。此時大部份的牛都可用補體結合試驗 (CF test) 檢測出它的陽性感染反應。抗體在疫苗注射兩個月消失，它的局部反應因發生率、發生強度、動物品種和疫苗注射部位而有所不同 (18)。

5. 成品的品管測試

　　在推薦稀釋濃度下的冷凍乾燥疫苗在回甦之後，必須測定力價。

(a) 安全試驗

　對牛科或瘤牛的安全性檢查，必須根據第 B.4.c 節來進行。

(b) 效力試驗

　這個試驗是根據第 B.4.d 節來進行。因為牛接觸傳染性胸膜性肺炎 (CBPP) 不容易在實驗室的狀況下感染，而且它的價格關係，所以每一批的種菌生產中祗做一次力價試驗。