摘      要

焦蟲症(Babesiosis)是由壁蝨媒介所傳播之牛的疾病，它是由原蟲類寄生蟲即Babesia bovis、B. bigemina、B. divergens 和其它種類的焦蟲所感染而導致的疾病。B. bovis 和 B. bigemina 等焦蟲的最主要病媒昆虫(vectors)是牛壁蝨(Boophilus spp.)，它們廣泛分佈於熱帶和亞熱帶的國家。B. divergems焦蟲最主要的病媒昆虫是蓖麻豆蝨(Ixodes ricinus)。其它重要的病媒昆虫還包括血泡蝨(Haemaphysalis)和扇頭壁蝨(Rhipicephalus spp.)。

病原體的鑑別：死亡的動物假若細胞沒進一步溶解的話最適合由血液、大腦、腎臟、肝臟和肺臟所製成的抹片來檢查這寄生蟲。抹片經過甲醇固定之後用10%Giemsa染色20 ~ 30分鐘，放置於油鏡顯微鏡底下觀察。活著的動物則採取末梢微血管血液例如尾部的尖端來做厚或薄抹片檢查。

血清學試驗：最廣泛被使用來檢查 B. bovis 和 B. divergens 之抗體是間接螢光抗體(IFA)試驗。其它也可以用酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)來做抗體的檢查。

也曾用IFA來做為 B. bigemina 的血清學檢查，但是由於它的血清學交叉反應的影響使它在分類上造成很大的困擾。

需要的疫苗和診斷用生物製劑：許多國家已有由感染仔牛的血液製備出 B. bovis、B. bigemina 或 B. divergens 等的活化或不活化疫苗。它有低溫或冷凍兩種不同的保存方式的疫苗。冷凍疫苗由於比較容易做每批疫苗產品的品質控制，因此常被推薦使用。因為疫苗的取得來源是從血液，所以整個生產過程中的品質管理是非常重要的，但也因此使它的價格變得很昂貴。

活的焦蟲疫苗並非有絕對的安全性。較實際的推薦方法是限制使用在仔牛身上，如此可以減少疫苗產生的非特異性反應的危險。當要用疫苗接種成牛時必需在接種後隨時觀察它的反應，如果發生不良反應的話應立刻投與殺焦蟲葯。

在單一次接種之後保護性的免疫抗體可以在3 ~ 4週後產生，並且可以維持數年之久。

A.   診 斷 技 術

牛焦蟲是由原蟲之寄生蟲所感染，它屬於 Apicomplexa 門 (phylum) 的梨形目(Piroplasmida order) 的焦蟲屬 (Babesia genus)。兩種最主要感染牛的焦蟲是 B. bovis和 B. bigemina。這兩種的焦蟲在世界上廣泛分佈，但最重要是在非洲、亞洲、澳洲以及中和南美洲。在歐洲西北部B. divergens是一項很重要的疾病。

焦蟲病的病媒昆昆蟲是壁蝨(tick)(13)。在熱帶和亞熱帶最重要的病媒昆蟲是牛壁蝨(Boophilus microplus)，而對 B. divergens 來說則是蓖麻豆蝨(Ixodes ricinus)。其它比較重要的病媒虫是血泡蝨(Haemaphysalis)、扇頭壁蝨(Rhipicephalus spp.)和其它種類的牛壁蝨。一般來說雖然 B. bigemina 分佈更廣泛而且有比較高的傳播率但事實上 B. bovis 更具有病原性。B. bovis 感染的症狀是運動失調、食慾缺乏和全身性循環休克，因為會造成腦中微血管的紅血球之腐死所以經常也會伴隨著神經症狀。在急性病例中造成最嚴重的寄生蟲血症(感染紅血球的百分比)時其循環血流中祗有1%的被感染紅血球。和 B. bigemina 的感染比較，它的寄生蟲血症(parasitaemia)通常都超過10%有時更高達30%，它主要的症狀是發燒、血色素尿(haemoglobinuria)、血色素血症(haemoglobinaemia)和貧血，但它不會導致血管內紅血球的腐死。B. divergens 的病原性比 B. bovis 弱，它所發生的寄生蟲血症的情形和 B. bigemina 感染非常類似(14)。

一旦動物感染任何一種焦蟲，它會產生終生的免疫力。由實驗感染 B. bigemina而得到免疫的動物在之後感染 B. bovis 的情形來看，它們之間具有某種程度的交叉免疫性。年幼動物對感染比較具有抵抗性，仔牛吸食來自感染或沒感染焦蟲之乳牛的初乳對其後來抵抗 B. divergens 都沒影響(6，7)。

1. 病原體的鑑別

從死亡動物身上所取得的樣本必需包括血液薄抹片以及由(按照優先次序)大腦皮質、腎、肝、肺和骨髓所採集的抹片。器官的抹片是用玻片壓在新切開的切面表面或是用兩片玻片將中間的組織塊壓碎而製成。抹片經風乾後，用無水甲醇固定5分鐘，再用10%的Giemsa染色20 ~ 30分鐘。這個方法最適合用在 B. bovis 感染的診斷，但是如果動物死亡已超過24小時以上的話則無法得到滿意的效果。但如果動物已死亡1天以上時可以自下肢的靜脈所取得的血液來做抹片也可以檢查出蟲體的存在(1)。

由活著的動物所採的樣本必需包含厚和薄層血液抹片。因為 B. bovis 最常存在於微血管裡，所以採血最好的位置是末梢血液如耳尖或尾部的尖端。而B. bigemina 和 B. divergens 兩種則平均分佈於全身的血液中。假若無法由微血管取得新鮮血液抹片時，則用加入乙二胺四醋酸(EDTA)抗凝劑(例如1公克/毫升)以無菌的方式自頸靜脈採集血液。肝素(heparin)因為會影響染色的顏色所以不可使用。樣本在送至實驗前必需置於5℃的低溫下，但採樣後最好在數小時內即完成輸送。薄血液抹片待其自然風乾後以無水甲醇固定1分鐘，並用10%的Giemsa染色20 ~ 30分鐘。抹片最好是在最短的時間內便加以染色才能得到最好的染色效果。厚血液抹片是用一小滴血液(約50μl)放在乾淨的玻片上，待其自然風乾之後用無水丙酮固定5分鐘，最後再用5%的Giemsa染色20 ~ 30分鐘。

所有的染色抹片都在油鏡下用(最小倍數)x 6的目鏡和x 60的物鏡來觀察。B. bovis 是一種小型寄生蟲，通常是位於紅血球的中央。它大約是1 ~ 1.5μm長和0.5 ~ 1.0μm寬的蟲體，並且經常以鈍角的一邊相對的方式成對出現。B. divergens也是一種非常小的寄生蟲，在形態上和B. bovis非常類似，但它成對的鈍角則經常位於紅血球的邊緣。B. bigemina則是比較長形的寄生蟲，它也經常以成對的方式出現但是以銳角相對，它形態上呈梨形，但有時常以單獨的方式出現，它的大小是3 ~ 3.5μm長和1 ~ 1.5μm寬，成對型式的蟲體各別有兩個分開的紅色染色點(B. bovis和B. divergens通常祗有一個紅色染色點)。在急性期時，B. bovis的寄生蟲血症很少達到1%，但是B. bigemina和B. divergens的寄生蟲血症則比B. bovis高出很多。厚血液薄片比器官抹片特別是對診斷低濃度的B. bovis感染有更好的效果(1)。

懷疑是帶原者的動物感染的確診是將它的血液輸約500毫升到切除脾臟並已知沒有被焦蟲感染的仔牛身上，並觀察它的感染出現情形。B. divergens可以感染蒙古種沙鼠(Mongolian gerbils)。最近幾年已有用試管培養的方法來診斷帶原動物的低濃度感染以用來分離此病原寄生蟲(17，26)。如果有適合的培養設備的話試管內分離病原的技術可能會比在活體內所做的更高。也有用DNA探測和聚合酵素鏈反應(PCR)的技術來偵測低濃度的焦蟲感染(7，11，12)。這些試驗比用顯微鏡來觀察更有敏銳性，但仍比在活體內或試管內之分離方法不敏感。

2. 血清學試驗

(a)       酵素結合免疫吸附試驗

已有酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)的診斷盒提供做診斷B. bovis感染工具。但雖然經過許多實驗室裡多人的努力，到目前為止還是沒有可用的ELISA可以供做診斷B. bigemina之用。最近的研究曾報告(10)B. bigemina的抗血清似乎可以和非特異性的纖維蛋白原(fibrinogen)產生反應。下列是B. bovis診斷盒的製造原理。

抗原的製造是採用Goodger等人(16)和Waltisbuhl等人(28)的技術。感染的血液(通常是5 ~ 10%寄生蟲血症的血液)是採集自切除脾臟的仔牛並加入EDTA而得來的。血液用五倍體積的磷酸緩衝溶液(PBS)洗三次，然後藉低張生理食鹽水使未感染紅血球溶解的方式使它和感染的紅血球區分開來而得到濃縮。被感染的紅血球比未感染的紅血球較不易被低張溶液所溶解。準備一系列不同濃度的低張生理食鹽水溶液，其範圍從0.35%到0.50%的氯化鈉，並以間隔0.025%的距離來增加濃度。為了找出最適合的血球溶解濃度，用五倍體積的生理食鹽水加入一體積的濃縮紅血球(RBC)，並在溫和的攪拌之後放置5分鐘。

再將以上的混合物離心並用吸管吸出其上清液。將等量的血漿(由最早的血液保留下來的)加入含濃縮紅血球的試管中後並攪拌均勻。再由以上的溶液來製作血液薄膜片，用甲醇固定後再以Giemsa染色。檢查這薄抹片看它被感染的紅血球是否在這分離過程中 >95%以上都沒有損傷，一般來說在0.400 ~ 0.425%之間的生理食鹽水最適合做為這分離紅血球的濃度。

所收集的被感染之濃縮紅血球再用適當的生理食鹽水濃度使之分離溶解後再加以離心。將沉澱物(>95%的被感染紅血球)用蒸餾水在4℃下使之溶解後並在12,000公克下離心30分鐘。所得到含蟲體的小粒用PBS洗三次後再製成懸浮液，並在4℃下用離心的方法除去血紅素。在4℃下用1 ~ 2倍體積的PBS重新稀釋成懸浮液。採取適量的稀釋液在適當的速度下用超音波震盪60 ~ 90分鐘。所取得的溶液在4℃下用105,000公克超速離心60分鐘，保留其上清液。另外一個方法是，將這上清液和CM Sephadex混合後置於0.05摩爾pH5.5的PBS溶液下使其沉澱，然後再用離心的方法除去 Sephadex，這個方法可以除去更多的血紅素。將上清液用等量的甘油混合並在 -70℃下貯存在2 ~ 5毫升的等量小玻璃瓶裡。如果在短時間內即需使用的話則可貯存在 -20℃。

˙    試驗步驟

(1) 首先將100毫升的抗原用0.1摩爾pH9.6的碳酸鹽緩衝液稀釋成從1/400到1/1,600的溶液，並將此稀釋液放入96-孔聚苯乙烯(polystyrene)的微量滴定盤內之小孔中，並加蓋在4℃下放隔夜感作。

(2) 移除抗原後加入200毫升的2%酪朊酸鈉(sodium caseinate)溶液於碳酸鹽緩衝液，並在室溫下放置二小時使其中止反應。

(3) 中止反應後用含0.1% Tween 20(PBST)的 PBS大略沖洗一下，再加入100毫升用含5%正常馬血清或5%脫脂奶粉(注意：每一批的奶粉裡可能含有不同的母體抗體)的PBST稀釋成1/100的牛血清。再將它於室溫下培養二小時。

4) 在室溫下培養二小時之後，再用PBST大略洗一次後緊跟著再用同樣的溶液洗三次每次五分鐘(在洗的時候將微量滴定盤用力地搖動)，最後再大略地洗一次。

(5) 接下來，加入100毫升以含馬血清或脫脂奶粉的PBST做適當稀釋的過氧化酵素-標示(peroxidase-labelled)的抗牛免疫球蛋白，並在室溫下搖動使其作用30分鐘。

(6) 用上面所述的方法清洗小孔後在每一個小孔內加入100毫升的過氧化物基質〔2.2’-Azino-bis（3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonic acid）〕(ABTS[2.2’-連氮基-雙-(3-苯甲酸-氫塞唑-6-磺酸)])。30分鐘之後於吸光度414ηm下用微量滴定盤判讀器(microtitre plate reader)下讀取結果。

為了避免同一微量滴定盤內的差異，必需放入已知的陽性和陰性對照血清(28)。並且包含一強陽性血清，並且使其繼續反應直到吸光值達到1為止。測試血清按照相對的陽性對照血清來排列。ELISA的結果是以陽性對照血清的百分比來做比較(陽性百分比 –PP)。

每一批的抗原和軛合物必需用棋盤式(checkerboard layout)方法重新滴定。使用中的抗原稀釋液必需在1/400和1/1,600的稀釋倍數之間。最適合用來做為酵素結合軛合物的基質是辣根過氧化酵素(horseradish peroxidase)和ABTS或是四甲替聯苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)。軛合物的最後稀釋倍數得視製造廠商而定。

這試驗在單一接種至少四年後仍可測出它的抗體。它們用在B. bovis免疫的動物必需有95 ~ 100%陽性反應率，對陰性血清有1 ~ 2%的假陽性反應，而對用B. bigemina免疫的動物則有 <2%的假陽性反應。

(b)       間接螢光抗體試驗

˙ 抗原的製備

檢查抗原之抹片的血液是來自頸靜脈，最理想的採血時間是在寄生蟲血症達2%到5%之間時。

採血之前加入適合的抗凝劑 (檸檬酸鈉或是EDTA)，並用五到十倍體積的PBS至少洗三次以便去除污染的細胞漿蛋白質特別是宿主的免疫球蛋白。洗過之後，重新用二倍體積含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS配成懸浮液。牛血清白蛋白是用來做為使紅血球和玻片粘著之用。一般較喜歡用一滴血液放在乾淨的玻片上，然後再放入細胞離心器(cytocentrifuge)離心來製備單層血液薄片，如此可以做出非常均質的抹片。血液薄片也可以用一般的方法來製作。此血液抹片在風乾後在室溫下用丙酮(acetone)固定5分鐘。最後將固定好的血液薄片緊密地包起來置於 -70℃之下貯存以備使用(18)。

˙    血清用二倍或三倍的方法做一系列的稀釋，開始的稀釋倍數在1/90到1/100之間。超過此稀釋濃度的血清都被視為陽性。血清可以用56℃作用30分鐘使之不活化，但也可以不必加以不活化。將這血液抹片用油性筆做記號使其分成8 ~ 10等份的1毫米方格。用小吸管在每一個方格內加入5 ~ 10μl各種稀釋倍數的血清。然後將其培養在室溫下1 ~ 2小時或是在4℃潮溼的密閉室裡放置隔夜。為了方便對照，每一次試驗都必需加入稀釋成適當濃度的陽性和陰性血清和軛合物的對照。

培養後，用PBS將抹片輕微沖兩次，然後再用PBS做兩次10分鐘的洗淨過程。在每一個測試方格中加入經過適當稀釋並用異硫氰酸鹽螢光素(fluorescein isothiocyanate)(有商業用產品)標示的抗牛免疫球蛋白抗體。每一批新的軛合物都必需滴定，稀釋範圍在1/400和1/1,200之間。軛合的兔和雞抗體通常都比羊的抗體較適合用於此試驗。經過軛合的玻片培養在4℃下放置隔夜後用PBS做三次5分鐘的洗淨。潮溼的抹片在含10%甘油的PBS下用蓋玻片蓋上，最後放置於標準的螢光顯微鏡下檢查。有經驗的操作者可以在一天之內檢查150件樣本。

(c)        其它的試驗

最近幾年曾被提出的血清學試驗是點式酵素結合免疫吸附試驗(dot ELISA)(23)、玻片酵素結合免疫吸附試驗(slide ELISA)(21)和乳膠凝集試驗(latex agglutination test)(2)。這些試驗對檢測 B. bovis 有很高的敏感度和特異性，點式酵素結合免疫吸附試驗(dot ELISA)更對檢測 B. bigemina 也有同樣的敏感度和特異性。因為除了針對這試驗所做過的研究之外，一般在實驗室裡都沒有用這些試驗來做為例行的診斷工具，因此它用在實驗室的例行診斷之適用性至今仍不明白。

B.  需要的疫苗和診斷用生物製劑

在一次感染過B. bovis、B. divergens或B. bigemina等之後即可得到耐久、長期的免疫反應。在許多有國家都利用這特性來做為焦蟲的防疫方法(1，5，9)。大部份的活毒疫苗都含有一至二種特別選擇的病原，並且在國家的支援之下針對那些國家所關注的畜產事業來做服務。也有用在試管內繁殖的抗原來做疫苗(24，26)，但它們祗能提供部份的保護效果(27)。曾經研究過寄生蟲蛋白質的特性(7，15，22，29)，已有許多被採用來做為基因工程上的免疫原(immunogens)。但在目前為止這類產品的疫苗仍沒有用在商業上。

本章是以活焦蟲疫苗做為疫苗的製造方法。它的過程包括用特別選擇的寄生蟲株來感染牛並採收它的血液做為疫苗。接種的牛必需沒有可能會藉製造疫苗的血液而傳播的病原存在。關於這疫苗的製造過程已有詳盡的報告(1，5)可供參考，所以有關製造疫苗的更詳細資料可以參考這些報告。目前也有用試管來繁殖蟲體以做為疫苗的方法(9，20)，但由於它們的製造成本相當高，並且長期於試管內培養焦蟲的結果會使它們的抗原性產生變化，因此這種疫苗的生產方法在目前的實驗來說仍不符合實際。

視實際的需要、輸送的情況和液態氮或乾冰的供應情形 B. bovis 和 B. bigemina的疫苗有冷凍或是低溫保存兩種。因為每批成品的品質管理上較容易的關係，所以大部的情況下都推薦使用冷凍疫苗(8，9，25)，但和低溫保存的疫苗比較，它的成本比較高而且也比較不容易輸送。由於它們是經由血液來製造疫苗，因此很容易受到污染，在此狀況下產品必需對可能的污染做嚴格的控制，但往往在有此流行病的國家並無法符合這個要求(9)。

1. 種菌的管理

(a)       種菌的特性

˙  世界上可用的病虫株

減毒的澳洲 B. bovis 和 B. bigemina 株已被有效地製成疫苗，使用在非洲、南美洲和東南亞地區(8，9)。也有經由壁蝨感染和非經由病媒昆蟲感染的焦蟲株。在瑞士所使用的 B. divergens 株是未經過減毒的。

˙  區域焦蟲株的分離和純化

可以用被感染的壁蝨上的蟲體接種到有感受性且切除脾臟的牛身上，由這種方法可以得到沒有受到例如邊虫、附紅血球蟲體屬(Eperythrozoon)、Theileria氏蟲、錐蟲(Trypanosoma)以及各種病毒和細菌病原體所感染的B. bovis、B. divergens和B. bigemina等純焦蟲株(1)。B. bovis和B. bigemina兩種焦蟲的病媒昆蟲和傳播方式不同，所以可以利用這種特性來分離這兩種不同品種的焦蟲(13)。

焦蟲也可以經由感染焦蟲之牛的血液接種到有感受性且切除脾臟的仔牛再加以分離。這個方法主要的缺點是很難將其它的病源例如邊虫和附紅血球蟲體屬(Eperythrozoon)從焦蟲病原中分開來。將分離的焦蟲培養在試管裡(26)可以避免受到污染，但無法將這兩個品種的焦蟲分離開來。媒些化學治療劑可以將 B. bovis 和其它的焦蟲分離開，而在有感受性的仔牛身上快速繼代也可以分離出焦蟲(1)。

˙  病虫株的減毒

許多報告都有提及將焦蟲減毒的方法。最普遍被使用來將 B. bovis 減毒的方法是通過有感受性切除脾臟的仔牛快速繼代。繼代次數並無一定的準則可循，但是通常都是經過8 ~ 20次的仔牛繼代之後。

在潛伏性感染的動物身上因為 B. bigemina 已在體內停留很長一段時間所以毒性也會降低。利用這個特性可以得到無毒性的原蟲株，它的方法是將病原每隔3個月在未切除脾臟的仔牛繼代一次，在最後3個月時則繼代在切除脾臟的仔牛，然後用經過這過程繼代的焦蟲做為繼代和製造疫苗之用(1)。

用放射線照射也可以用來使焦蟲減低其毒力，但它的效果差異很大。以含有馬血清的培養基在試管裡培養也可以使 B. bovis 的毒力減弱。

保存在冷凍的無毒虫株必需做安全的測試，以便將來做為疫苗使用。

(b)       穩定物的製備和貯存

無毒的病虫株是貯存於液態氮或乾冰使其成為冷凍之穩定物。二甲亞風(Dimethyl sulphoxide, DMSO)和聚乙烯比咯烷酮(polyvinyl pyrrolidine)分子量為40,000因為可以在穩定物溶解後一同由靜脈投與血管(1)，所以常被推薦用來做為低溫保存劑(cryopreservative)。其它有一些關於這DMSO的冷凍技術報告(1)，但這裡簡單摘要如下：收集被感染的血液，置於4℃下並在攪拌下緩緩加入低溫保存劑 (4摩爾DMSO溶於PBS)，調配成血液/低溫保存劑的比例為1：1，並最後為2摩爾DMSO的濃度。全部稀釋的操作過程是在冰浴下進行的，這稀釋的血液最後被分裝到合適的容器裡(例如5毫升的低溫試管)，並儘快置於液態氮的容器裡加以冷凍保存。

(c)        合格的疫苗

所製成的疫苗是否適合使用可以用接種到有感受性的動物身上來做實驗。先觀察它對疫苗的反應情形然後用具有毒力、異源病虫株來攻擊。它們的安全性和疫苗效力可以藉染色血液薄片、發燒情形和對濃縮紅血球容量(PCV)的抑制情形來觀察它產生寄生蟲血症的情形。可以牛血清來做血清學試驗來測定這分離物純化的程度以做為安全性的參考，這些試驗必需針對那些可能存在的污染來進行。

2. 製造方法

(a)       冷凍疫苗的生產

將小玻璃管浸入預熱至40℃的水中使這一定量的冷凍穩定物(5 ~ 10毫升)溶解。這溶解後的物質置於冰中儘速使用(在30分鐘內)來靜脈接種於具感受性且切除脾臟的仔牛身上。

每天自頸靜脈採血做染色抹片檢查以隨時掌握仔牛產生寄生蟲血症的情形。1 x 10⁸/毫升(頸靜脈血液約含2%的蟲體)的蟲體是製造疫苗時所需的最低蟲體含量。如果 B. bovis 的蟲體量沒有辦法達到這個標準時必需再以100 ~ 500毫升的血液再接種到第二隻切除脾臟的仔牛身上做次繼代。B. bigemina 並不合適做繼代。

用套管針由頸靜脈或頸動脈處以無菌方式採集血液，並加入肝素(heparin)做為抗凝劑(5國際單位肝素/毫升血液)。

在實驗裡這感染血液用等量含3摩爾甘油和5毫摩爾葡萄糖的PBS在37℃下稀釋(甘油最後的濃度是1.5摩爾)。這稀釋液放置於37℃下30分鐘使其均衡化後再分裝到適合的容器裡(例如5毫升的低溫小玻璃管)。這些小玻璃管再用液態氮以每分鐘10℃的速度加以冷凍，並以液態狀況貯存(8，9)。

在有甘油的情況下可以用DMSO來做為低溫保存劑。它的操作方法和製備穩定物的方法一樣(25)。

假如要稀釋甘油化的疫苗，這稀釋劑必需有等滲透壓以及含1.5摩爾的甘油和5毫摩爾葡萄糖的PBS(19)。用DMSO低溫保存的疫苗如果要再做稀釋時必需有等滲透壓並且要用原來低溫保存之血液一樣濃度的DMSO (25)。

(b)       低溫疫苗的生產

低溫疫苗的生產方法和冷凍疫苗的生產方法相同，但它們必需在最短的時間內使用完畢。這感染的血液必需稀釋至每劑含1 x 10⁷蟲體的疫苗。最合適用來做為稀釋劑的溶液是以磷酸緩衝液所配成之10%減菌牛血清，這磷酸緩衝液每公升裡含有下列成份的鹽類：NaCl(7.00公克)、MgCl₂.6H₂O(0.34公克)、KH₂PO₄(0.90公克)和NaHCO₃(0.52公克)。

含 B. divergens 的血液可以用Hanks’溶液來稀釋。假如無法取得稀釋液的話也可以用檸檬酸右旋葡萄糖 (acid citrate dextrose)檸檬酸磷酸右旋葡萄糖(citrate phosphate dextrose)以1比4的比例做為抗凝劑，並提供適量的葡萄糖作為蟲體活存之用。

(c)        疫苗的使用

使用冷凍疫苗時必需先將含疫苗的小玻璃瓶置於預熱至40℃的水中溶解。如果是製備成甘油化的疫苗時必需將它保存在低溫之下並且在8小時之內必需使用完畢(8，9)。假如是用DMSO做為低溫保存劑的話，疫苗一定要用冰塊保存並且在15 ~ 30分鐘內一定要使用完畢(25)。

低溫保存疫苗一定要置於冰箱，並且在製備好6天內使用完畢。

疫苗所使用的 B. bovis、B. divergens 和 B. bigemina 等雖然是經過減毒，但並非絕對安全。因此建議當可以利用非特異性的免疫反應時儘量減少疫苗的使用。較大的動物注射疫苗時會有嚴重疫苗反應的危險，雖然它們不是經常都會出現，但是如果用在經濟價值較高的種畜或懷孕動物身上時必需在注射疫苗後連續3週每天仔細觀察它的反應。最好是量接種牛直腸的體溫而且有發燒的情形時必需加以治療。一般 B. bigemina 和 B. divergens 所產生的反應會在第6 ~ 8天時出現，而 B. bovis 所產生的反應則會在第10 ~ 16天時出現(5)。

免疫的保護效果會在3 ~ 4週內產生，並且通常可維持數年之久。

焦蟲和邊虫的疫苗經常都同時使用，但我們建議不可和其它的疫苗一起使用(5)。

3. 過程中的控制

(a)       疫苗生產動物的來源和維持

使用沒有感染焦蟲和其它任何由壁蝨媒介之疾病的仔牛做為培養製造疫苗之焦蟲的來源。假若以上的仔牛不容易取得時，另一個辦法是將仔牛養在沒有壁蝨感染的環境裡，特別是用在製造疫苗的仔牛更需要如此。

這仔牛必需養在沒有任何傳染病和壁蝨以及可能叮咬的昆虫之環境裡。如果沒有合適的飼養設備時必需時常測試是否有受到當地傳染性疾病的感染，所以地區性製造的疫苗的優點(取代從國外進口合適的疫苗)必需要和它以上所提及之可能產生的危險之間做一個客觀地評估(1)。

(b)       外科手術的操作方法

做為生產蟲體的仔牛必需切除其脾臟以便使其產生最大量的蟲體來製造疫苗。手術前最好按照一般的外科手術的麻醉方法來麻醉仔牛。其它詳細的外科技術，包括手術前和手術後的過程請參考文獻報告(1)。

(c)        接種前仔牛的篩選

做為接種用的仔牛必需檢查是否沒有疫苗生產地的任何經血液感染的疾病，它包括焦蟲病、邊虫病、Theileria病和錐蟲病等。檢查的方法是在做脾臟切除手術之後定期做血液染色抹片檢查，如果可能的話也做血清學的檢查。如果發現任何仔牛感染了以上所提的疾病時必需將之淘汰。同時也要檢查是否感染任何其它的疾病，這些疾病包括牛地方流行性白血球增生病、粘膜病、牛感染性鼻氣管炎、赤羽病(Akabane disease)、牛流行性熱 bovine (ephemeral fever)、藍舌病、口蹄疫和牛瘟等。檢查的方法得視這疾病在當地的流行情形以及可用的診斷方法取得的方便程度，但最後都至少要做成對血清的血清學檢查，在某些情況還得做病毒的分離鑑定(8，25)。

(d)       接種後寄生蟲血症的監控

必需測出血液中蟲體的濃度。蟲體的數目已有精確的計數方法(1)，但也可以藉計算紅血球的數目和依照寄生蟲血症(感染紅血球的百分比)的情形來算出感染的蟲體的濃度。

(e)       血液的採集

所有的儀器在使用前必需經過確實的滅菌處理(例如經過高壓滅菌鍋處理)。一旦到達所需要的寄生蟲血症時用含有肝素的容器在嚴格的無菌操作下採集血液。最好是將仔牛麻醉後用封閉的採血迴路系統(closed-circuit collection system)來操作。

六個月的仔牛約可採集到3公升高度感染的血液。如果這頭仔牛要讓它繼續活存的話則必需用適合的血液再做輸血，否則這仔牛在採取全部血液之後必需立刻撲殺。

(f)         疫苗的分裝

所有的操作過程必需在適合的環境下進行，例如在無菌操作箱(laminar flow cabinet)內，並且必需依照標準的滅菌程序。並且在分裝的過程中用機械或磁性攪拌器使血液和所有的稀釋溶液能充份地混合均勻。

4. 分批控制

低溫疫苗無法針對它們每批的生產做力價、安全性和滅菌程度的測定。冷凍的疫苗則視每個國家而有所不同。以下為澳洲製造冷凍疫苗的方法。

(a)       滅菌和防止污染

每批的疫苗和稀釋溶液都做無菌的標準測試。疫苗是否有受其它病原污染的檢查方法是用血清學方法針對可能污染的病原做測試。這裡可以利用測試接種後之牛的力價測定方法(參考第B.4.c節)。疫苗可能存在的污染病原為牛地方流行性白血球增生病、牛傳染性鼻氣管炎、粘膜病(mucosal disease)、牛流行熱 bovine (ephemeral fever)、赤羽病(Akabane disease)、Aino病毒、藍舌病、流產布氏桿菌和鉤端螺旋體(Leptospira)等。在澳洲已經根絕的疾病，所以不列為檢查的對向有口蹄疫、粗皮病(lumpy skin disease)、狂犬病、里夫特谷熱(Rift Valley fever)、牛瘟、傳染性牛胸膜肺炎、水胸病(heartwater)、Jembrana病、和有病原性的Theileria病原和錐蟲(8，9)。

(b)       安全性

疫苗的反應是由接種後的牛來觀察(參考第B.4.c節)，觀察其寄生蟲血症和對濃縮紅血球容量(PCV)的壓制情形做為安全性的參考。祗有在致病原程度等於或低於先前所測量的標準時才能做為疫苗之使用。

(c)        力價

冷凍疫苗溶解後並用等張稀釋液稀釋成1/50(8，9)。將這稀釋液培養在30℃下8小時後再用2毫升劑量以皮下方式接種於五頭牛。採取血液製作染色抹片來觀察感染的情形。所有接種動物都受到感染時則表示這批疫苗可以使用。稀釋1/50後測試為有效之疫苗在推薦使用時是以等張溶液再稀釋成1/5倍。

(d)       免疫有效時間

一次的接種後可產生長期的免疫作用。曾有使用 B. bovis 疫苗失敗的報告(3，9)，失敗的原因和焦蟲疫苗虫株的選擇、出現野外異源株和宿主的因素都有關係。並沒有證據顯示免疫力會隨著時間而有所不同(5)。

(e)       穩定性

貯存於液態氮的疫苗可以保存5年的時間。但一旦溶解後它的效果就會很快地降低。溶解後的疫苗不能再重新冷凍保存。

(f)         保存劑

不需加入任何保存劑。在疫苗分裝時加入青黴素(500,000單位/公升)和鏈黴素(370,000μg/公升)。

(g)       注意事項(可能的危險)

這疫苗不會感染人類，但曾有切除脾臟的病人感染 B. divergens 的病例。當產品用液態氮貯存時，它在貯存、輸送和處理時和其它用低度冷凍的物質所用的方法相同。

5. 成品的測試

(a)       安全性

參考第B.4.b節。

(b)       力價

參考第B.4.c節。