出血性敗血症
- 建立日期
- 96年01月10日
- 更新日期
- 96年01月10日
- 內容
摘 要
出血性敗血症(Haemorrhagic septicaemia, HS)是由特定血清型的敗血巴氏桿菌(Pasteurella multocida)引起牛和水牛的急性、高死亡率的敗血性疾病。它是一種原發性的巴氏桿菌病(Pasteurellosis)，純培養的病原菌本身即可使有感受性的動物引起同樣的疾病。
診斷出血性敗血症全靠從死亡動物的血液或骨髓中用培養或生物學上的方法分離出它的病原菌，以及用生物化學和血清學的方法來鑑別並分類病原菌。
病原菌的鑑別：敗血巴氏桿菌的純培養可以將病材用人工培養基培養或將病材接種小白鼠，死後將它們的血液培養於適合的培養基。鑑別的方法是依據敗血巴氏桿菌在形態、培養和生物化學上的特性。
特定血清型的鑑定是用一種以上的血清學方法來做測試，這些方法包括快速玻片凝集試驗(rapid slide agglutination)、用已結合細菌萃取物的羊紅血球以間接血球凝集試驗(indirect haemagglutination)來做細菌 "莢膜"的分類、用熱處理細胞萃取物以膠內免疫擴散試驗(agar gel immunodiffusion tests)來做細菌 "體"的分類或用酸處理細胞來做凝集試驗。
血清學的試驗：一般不用檢測特異性抗體的血清學方法來做為本疾病之診斷。 需要的疫苗和診斷用生物製劑：針對出血性敗血症的疫苗可用福馬林不活化的細菌或是加入佐劑的濃縮菌苗。後者可以使免疫的反應加強和延長免疫的有效時間。
製造疫苗所需的種菌需含完整莢膜。疫苗的標準化是依據濁度試驗(turbidity tests)來測出細菌的密度。力價試驗可以很容易地使用小白鼠來進行。
A. 診 斷 技 術
出血性敗血症(HS)是由特定血清型的敗血巴氏桿菌(Pasteurella multocida)所引起牛和水牛的急性、高死亡率的敗血性疾病(2，6 ~ 8)。目前已確認有兩種血清型 - 亞洲和非洲血清型。有三種血清型的分類方法可以應用 - 以間接血球凝集試驗(IHAT)來做細菌 "莢膜"的分類(3)、以凝集試驗(agglutination)來做細菌 "體"的分類和用膠內免疫擴散(AGID)試驗(9 ~ 11)。亞洲菌株是屬於莢膜B型(capsular type B)，非洲菌株屬於E型。體抗原分類用凝集試驗(agglutination)時，所有菌株屬於第 6 型，用膠內免疫擴散(AGID)試驗則屬於第 2 型。
臨床診斷依據特徵性症狀、肉眼病變、群體病歷、感染率和死亡率的型態、品種感受性、感染年齡層等。暫時性的診斷方法一般都是用來做為疾病控制的參考。
實驗室的確診是藉細菌分離或小白鼠接種後，分離到的病原菌，再用生物化學或是血清學的方法來鑑定。一個非常有用的例行診斷方法是接種小白鼠，再採小白鼠的血液做血液抹片以及培養病原菌後，再用快速玻片凝集試驗來檢查。再更進一步的確診則需用生物化學的方法和傳統的血清學試驗。
出血性敗血症的臨床症狀為疾病開始時的體溫昇高(經常會被忽略)、呼吸道的症狀和疾病後期的敗血症，通常復發後會導致死亡。潛伏期通常為2 ~ 3天，病程可能由沒有臨床症狀而突然暴斃到出現為期約5天的臨床症狀(6，8)。
死後的檢查第一個明顯病變是皮下水腫，特別是在頜下和胸部的地方。其它的病變包括紫點到瘀血的出血、充血和/或肺部實質化、胸膜炎和心包炎等(6，8)。
一般來說水牛比牛對出血性敗血症有更高的感受性，並且它的病程也很短。在疾病流行的地方可以發現大部份的死亡都發生在年紀較大的牛和年輕的成牛。在非地方流行性的地區，可能發生廣泛的流行性疾病。假如沒有治療的話死亡率可能高達100%(6，8)。
1. 病原菌的鑑別
˙ 培養和生物化學方法
出血性敗血症的敗血症出現在疾病的後期，因此在動物死亡之前所採集的血液樣本並不一定含有敗血巴氏桿菌。另外，它也不會持續存在於患病動物的鼻分泌物裡。
如果在動物死後數小時即採取血液樣本或從心臟取得拭物可以得到滿意的結果。假如已死後一段時間則採取去掉組織的長骨。假如沒有合適的設備做死後的檢查時，可以用切開或吸出的方式從頸部靜脈採取血液。在標準輸送用的培養基內的血液樣本必須置於冰塊下並避免滲漏。
感染動物的血液抹片用格蘭氏雷史曼（Gram Leishman's）或甲基藍染色，染色的細菌呈格蘭氏陰性、雙極染色的短桿菌。單獨直接用顯微鏡鏡檢並無法作確診。
一個適合巴氏桿菌生長的培養基是含5%血液的酪蛋白-蔗糖-酵素(CSY)瓊脂培養基。這培養基內含酪蛋白水解物(casein hydrolysate)(3公克)、蔗糖(3公克)、酵素萃取物(5公克)、氯化鈉(5公克)、無水雙鉀氫正磷酸鹽(3公克)和用蒸餾水加至1公升。在加入1.5%的瓊脂之後將pH調整為7.3 ~ 7.4。培養基用1 大氣壓的高壓滅菌鍋處理15分鐘。在冷卻至45 ~ 50℃時加入5%的牛血液(無禽敗血巴氏桿菌抗體)(15)。
將血液樣本或拭物浸入2 ~ 3毫升的滅菌生理食鹽水裡並加以培養。另外，如果是用長骨的話，則用酒精擦拭長骨表面之後，再用火焰消毒，並把它劈開，用無菌操作法抽取出骨髓後做培養。通常，如果所採得的樣本新鮮而且沒有受到污染時，直接培養就可以得到滿意的結果。
做生物學檢查時，用小量(0.2毫升)的血液浸溶於生理鹽水或棉棒溶出液的骨髓接種到小白鼠的皮下或是肌肉內。這小白鼠在生物學上是用來做為 "篩除"其它的微生物之用途。小白鼠在接種後24 ~ 36小時後死亡，這時由血液抹片中可看到敗血巴氏桿菌，並且沒有其它病原菌的感染。用這種方法甚至於由死亡多日的屍體上所取得的樣本亦可以做敗血巴氏桿菌的純培養，這時可以做病原菌形態學和培養上特性之觀察和生物化學反應以及血清學的試驗。
在血液瓊脂培養基37℃下培養24小時後的新鮮敗血巴氏桿菌菌落是光滑、灰色閃爍半透明的菌落，它的直徑約1毫米。在CYS培養基生長的菌落較大，但在老培養基特別是不含血液的培養基生長的菌落則較小。敗血巴氏桿菌並不能生長在MacConkey瓊脂培養基上。它在格蘭氏染色下的血液或是組織抹片呈現格蘭氏陰性、短、圓的雙極性染色的類球菌狀。它有某種程度的多形性特性，特別是在老培養基底下時更是如此，它呈長短不等的桿狀。雙極性染色的特性，如果用甲基藍或Leishnman!s染色時，會更為明顯。
出血性敗血症的菌體會產生氧化酉每 (oxidase)、過氧化氫酉每 (catalase)和口引口朵(indole)並且會還原硝酸鹽(nitrates)。它們不會產生硫化氫(hydrogen sulphide)或尿素酉每 (urease)並且無法利用檸檬酸鹽(citrate)或液化明膠(liquefy gelatin)。它們酵解葡萄糖和蔗糖之後祗產生酸。大部份的菌株也可酵解山梨糖醇(sorbitol)。一部份的菌株可以酵解阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)和麥芽糖(maltose)，但它們幾乎都不會酵解柳醇(salicin)和乳糖(lactose)。
˙ 血清學方法
有許多血清學方法被用來做為這造成出血性敗血症的敗血巴氏桿菌之血清型分類。它們包括快速玻片凝集反應(11)、間接血球凝集(IHA)試驗做為莢膜(capsular)的分類(3)、用鹽酸處理細胞的凝集試驗做為菌體(somatic)的分類(12)、膠內免疫擴散試驗(AGID)(1，9，16)和相對免疫電泳法(CIEP)(5)。
針對標準菌株在兔子體內所製成的抗血清可提供大部份的血清學試驗所用。在CYS肉湯培養基(約6 ~ 8小時)所培養的細菌接種到CYS血液瓊脂培養基上。經過隔夜培養之後(18 ~ 20小時)用含0.3%福馬林的生理鹽水洗下來。菌液的混濁度調整至Brown's第7號試管。用0.2、0.5、1.0、1.5和2.0毫升的菌液，每間隔3 ~ 4天以靜脈注射的方式接種到兔子體內。在最後一次接種之後再以0.5毫升的相同但是活的菌液用皮下或肌肉的方式注入兔子體內。兔子在10天後放血，並將血清貯存於 -20℃，血清小量分裝後，加入1/10,000乙基汞化鈉水楊酸鹽(merthiolate)後於4℃下貯存。
(a) 快速玻片凝集試驗(莢膜分類)
用一滴生理鹽水在玻片上和單一菌落混合後加入一滴抗血清，並將玻片輕微加溫。在30秒之內會出現粗糙、絮狀的凝集現象。較老化的菌落則會出現細小、顆粒狀的凝集反應，而且出現的時間也較長些。
(b) 間接血球凝集試驗(莢膜分類)
它原來是利用已經抗原人類"O"型活化的紅血球(3)，但最近則使用羊紅血球(14，15)，以下是抗原的製備方法：
將肉湯培養基上培養6 ~ 8小時的標準菌株接種到CYS血液瓊脂玻璃皿培養基裡，並在37℃下隔夜培養。用3毫升含0.3%福馬林的生理鹽水洗下所長成的菌落。將這懸浮液加熱至56℃30分鐘後在4℃下再以3,000g離心15分鐘，並將清澈的上清液貯存在 -20℃下。假若沒有冷凍離心機的話則在1,500g 離心30分鐘可出現一層上清液。用這上清液做為抗原的萃取物。
加入抗凝劑以無菌的方式採集羊紅血球，並用500g 離心10分鐘。將這濃縮紅血球以滅菌生理鹽水洗三次。抗血清(3份體積)用濃縮紅血球(1份體積)來吸附之後再用抗原的萃取物(15份體積)來使之作用1小時，並保持在37℃的溫度及不時地搖動的狀態下。 被作用過的紅血球用離心機收集，用生理鹽水洗三次再用生理鹽水做成1%的懸浮液。
這個試驗可以在試管或是平皿內進行，並以雙排的方式操作。第一孔內加入8滴的生理鹽水和2滴不活化被吸附的抗血清，其它的孔內則加入5滴的生理鹽水。將混合稀釋的血清取5滴置於倒數第二孔內，最後一孔則不加血清做為對照。第一排加入等量(5滴)1%被活化紅血球的懸浮液，而未活化的紅血球則加入到第二排以做為對照。平皿振盪並置於室溫下2小時。如果紅血球出現粗糙的凝集現象則表示陽性，如果紅血球呈現鈕扣狀的沉澱則為陰性。這試驗也可以在微滴定盤上操作，如此可以節省試劑。
(c) 膠內免疫擴散試驗
視所使用的抗原和抗血清之不同，膠內免疫擴散試驗可以用來分類細菌的 "莢膜"以及 "體"的抗原。它們是應用雙向擴散的試驗技術來進行的。在固體瓊脂培養基上打出六個圍繞中央一孔的小孔。
(1) 莢膜分類：使用1.0% Noble 瓊脂或相同性質的產品，並使之溶化在含1/10,000最終濃度乙基汞化鈉水楊酸鹽(merthiolate)的0.2摩爾之磷酸鹽緩衝溶液(1，16)。抗原和抗血清和間接血球凝集試驗所使用的相同(3)。標準抗血清置於中央小孔，被測試的抗原則置於周圍的小孔並和標準同源抗原交互放置。
(2) 菌體分類：使用特殊的Noble瓊脂或相同性質的產品，並用8.5%氯化鈉溶液配成0.9%的濃度。 (3) 用1毫升含0.3%福馬林之8.5%氯化鈉將培養在玻璃皿內的細菌收集起來以製備抗原。懸浮液加熱至100℃達1小時後用離心的方法使之沉澱，並使用其上清液作為抗原。 (4) 用雞來製備對抗16 種菌體型(9)抗原的抗血清。用含油質佐劑的菌苗(1毫升)皮下注入12 ~ 16週大的雄雞頸中央部位。在三周後再由胸部肌肉注1毫升及由兩邊胸骨注入0.5毫升的菌苗。一周後將雞殺死，分離其血清之後用0.01%的乙基汞化鈉水楊酸鹽(thiomersal)和0.06%的石碳酸保存。丟棄有交叉反應的血清。 (5) 被測試的抗原置於中央小孔，而對抗不同血清型的抗血清則置於週圍的小孔中。所有出血性敗血症的血清型(亞洲和非洲)都會和第2型抗血清起反應作用。第 5 型可能會有交叉反應發生。 (d) 相對免疫電泳法
相對免疫電泳法(CIEP)是莢膜B和E型抗原非常快速的鑑別法。
(1) 莢膜物質的製備：製備莢膜物質的方法和間接血球凝集反應所用的方法一樣。 (2) 抗血清的製備：抗血清是用兔子來製備，其方法和間接血球凝集反應所用的相同。 (3) 相對免疫電泳法的培養基：相對免疫電泳法所用的培養基含瓊脂醣(agarose)(2.0公克)、巴比通鈉(barbitone sodium)(2.06公克)、雙乙基巴比土酸(diethyl barbituric acid)(0.37公克)、蒸餾水(180毫升)和稀釋1/1,000的乙基汞化鈉水楊酸鹽(merthiolate)(20毫升)。 (4) 佛羅那草酸緩衝液(巴比通緩衝液)：巴比通緩衝液含巴比通鈉(barbitone sodium)(29.24公克)、無水草酸鈉(11.70公克)、0.1N的鹽酸(180毫升)以蒸餾水配成3公升，調整pH成8.8。 (5) 玻片的準備：進行電泳的平盤是預先用12毫升培養基包覆的玻板(57毫米 x 70毫米)。每組總共有7個孔，孔的直徑為4毫米孔和孔之間隔7毫米。組和組之間成列排列，平行的兩組之間中央孔距離6毫米。 (6) 操作方法：靠陰極的小孔加入20μl的莢膜抗原，而靠陽極的小孔則加入等量的抗血清。對照組是用0.85%的氯化鈉溶液對陽性抗血清和莢膜萃取物對陰性兔血清。電泳槽裡盛滿pH8.8的巴比通緩衝液。讓抗原和抗血清在150V(25V/公分)下電泳30分鐘。最後檢查這玻璃板的沉澱線。 (7) 結果的判讀：在抗原和抗血清的兩孔之間若出現明顯的線，則判定為陽性。 (e) 凝集試驗(菌體抗原)
菌體 "O"抗原是用之前所述的方法來製備的(10，12)。用培養6 ~ 8小時的細菌接種到CSY血液瓊脂並培養至隔夜。每盤玻璃盤用2 ~ 3毫升含0.3%福馬林的生理鹽水將培養的細菌收集起來，並在4℃下用3,000g 離心15分鐘(或是在室溫下用1,200 ~ 1,500g 離心30 ~ 45分鐘)。這細菌用25毫升的鹽酸生理鹽水(0.85%鹽水溶於鹽酸生理鹽水中)稀釋成混濁度約和Brown's第6號混濁管相同，然後隔夜放置。懸浮液再一次離心，去除上清液，細胞殘渣分別用pH5.0、6.0和7.0的磷酸緩衝溶液(PBS)洗。
最後用pH7.0的PBS將細胞殘渣製成相等於第6號Brown's管之混濁度的懸浮液。任何自我凝集的懸浮液必須捨棄不用。
製備對抗參考菌株6：B(亞洲型出血性敗血症)、6：E(非洲型出血性敗血症)和11：B(澳洲989，非出血性敗血症)之全細菌細胞懸浮液的抗血清。凝集試驗在玻片上進行，並用測試抗原進行對這三種型的血清做試驗。如果出現一條細小、顆粒狀凝集表示是特異性菌體抗原凝集反應。用於對抗標準抗原的試驗可以做為判讀的依據。如果出現非特異性部份凝集反應時，將對抗測試和標準抗原的血清做10倍稀釋可以幫助菌體抗原的鑑別。
(f) 血清型的設計
大略來說可分成兩種分類系統。一種是用Carter's間接血球凝集(IHA)試驗(3)或膠內免疫擴散試驗(AGID)(1，16)來區分的 "莢膜"分類。另一種是用Namioka和Murata(10，12，13)以及Heddleston、Gallagyer和Rebers(9)等人之細菌 "體"之分類方法。一般均同意血清型的設計必須包括細菌體-莢膜的組合。一般最常用的兩種系統是Namioka-Carter和Carter-Heddleston系統。用前一系統可以將亞洲和非洲出血性敗血症血清型分別設計為6：B和6：E，如果使用後一系統則它們的血清型分別為B.2和E.2。
2. 非血清學的方法
導致出血性敗血症的敗血巴氏桿菌有一個特性是能產生粘朊酵素(hyaluronidase)(4)。因此可以根據它培養上的特性和生物化學上的試驗和粘朊酵素的產生情形來做為它們分類的方法。必須注意的是，血清型B（除了B.2(或6：B)）和血清型E都不會產生粘朊酵素(hyaluronidase)。
用會產生玻璃酸(hyaluronic acid-producing)之細菌用垂直的方式劃過葡萄糖澱粉瓊脂(dextrose starch agar)玻璃平盤培養基中央。欲測試的巴氏桿菌交叉劃過。將培養皿培養在37℃下18小時。最早是用會生玻璃酸的馬鏈球菌(Streptococcus equi)，但較方便的方法是用含莢膜、粘樣的 A 型敗血巴氏桿菌。在交叉點粘樣玻璃酸產生之細菌會消失成為一條細線，顯示被測試的細菌會產生粘朊酵素(hyaluronidase)。用新鮮剛製備好的培養盤和有溼度的培養箱有助於玻璃酸的產生，可幫助結果的判讀。
3. 用血清學試驗來檢測抗體
一般不常用檢測抗體的血清學方法來作診斷。但需要注意的是，當用間接血球凝集試驗檢測到有高力價的抗體時，表示最近曾暴露在出血性敗血症的病原之下。出血性敗血症主要發生在那些用原始方式飼養的畜場，在這種情況下，疾病的通報系統常常是在疾病爆發後才知道。感染動物的死亡發生得很突然，並且發現後已沒有動物屍體可用來做為診斷。在這種情況下，其它曾經接觸過而存活的動物用間接血球凝集試驗(IHA)時，它的抗體力價高達1/160到1/1,280，甚至於更高。因此，由檢測到這情形時，也可以推斷最近曾接觸過此病原菌。
B. 疫苗和診斷用生物製劑之條件
用於出血性敗血症的預防有三種疫苗，它們是菌苗(bacterins)、明礬沉澱疫苗(APV)和油質佐劑疫苗(OAV)。菌苗要有產生足夠的免疫力的話，必須重覆接種幾次才有效。注射高濃度的菌苗可能會導致休克的反應，但APV疫苗則較少發生這種情形，而OAV疫苗則幾乎沒有這種情形發生。
1. 種菌的管理
(a) 種菌的特性
用本土分離發生的流行敗血巴氏桿菌菌株。必須用CSY血液瓊脂培養基培養出充份莢膜化、穩定並可以大量產生直徑約2毫米的大菌落的菌苗。種菌必須保存在半固體營養培養基在室溫下穿剌培養，或是用冷凍乾燥保存。
(b) 培養方法
用這培養的種菌感染小牛，在死亡後2 ~ 3小時，用無菌方法從心臟收集血液並分裝於1毫升等量的容器中貯存於 -20℃之下。每批製造疫苗時使用一份這裝於1毫升的血液。假如菌落的大小不減的話，這種菌可以再做一到兩次的繼代(subculture)。用先將含菌血液放入CSY血液瓊脂培養基溶解，培養菌落可用適當的抗血清來做凝集能力的測試。一個好的培養，可以在30秒內產生粗糙絮狀凝集物，而不良的培養則祗有細粒狀的凝集物。
(c) 合格的疫苗
純度試驗必須檢查菌種培養瓶及最後一次收成物，利用染色抹片檢查。檢查種菌是否有充份莢膜化，方法是將其培養在合適的培養基如CSY血液瓊脂培養基24小時之後，再觀察其菌落的大小。必須在種菌培養平盤、種菌培養瓶及在最後收成時，測定這抗原對血清的凝集性。收成後加入福馬林，放置6小時之後，再檢查細菌留存下來的活性。
2. 製造方法
製造疫苗時必須有高濃度的細菌懸浮液。它最少每公升必須含1.5公克乾燥的細菌。製造高濃度的懸浮液有兩種方法。第一種是培養在Roux瓶裡的固體培養基，並用福馬林化的生理鹽水來收集，由這種方法可使懸浮液達到所要求的濃度。這種方法是相當費力的，因為每一個培養瓶必須分開收成以及測試它們的純度。第二個方法也是我們所推薦的是用特別針對敗血巴氏桿菌之營養的暴露空氣培養基(aerated cultures)，它的成份是酪蛋白水解物(2公克)、蔗糖(6公克)、酵素脺取物(6公克)、氯化鈉(5公克)、無水雙鉀氫正磷酸鹽(1.36公克)最後用蒸餾水配成1公升。假如酪蛋白、蔗糖和酵母是經過濃縮、無菌過濾並以無菌方式輸送到已含其它成份並事先已滅菌處理的瓶裡時，細菌的成長會更稠密。
暴露空氣的培養方法有兩種～一種是旋轉式，另一種則是送氣式。無菌的空氣是來自壓縮機。旋轉式是由氣流中的推動軸之轉動而提供所需要的空氣，而送氣式則是由送氣管(sparger)將空氣直接輸入培養基。空氣分佈得越平均細菌的生長就越好。它經常需要使用20 ~ 40公升的容器，培養的溫度是37℃。在連續培養的系統裡，一般約在15小時之後，可以到達最高的培養密度，此時即收獲25%的培養液，然後每隔一小時重覆一次這個循環動作。雖然連續培養中，每次祗收獲一小部份，但在幾天之後，細菌的密度會變小了，很可能是細菌漸漸喪失它們的莢膜抗原之故。由於這個原因，所以按批來培養比較合適。假如每一批的培養瓶裡以50毫升/每升培養液的速度接種的話，在15 ~ 18小時之內可以得到最大的混濁度。細菌的生長可以加入終濃度0.5%的福馬林而使之停止。這個方法可以一次接種大量的接種物，並可以在很短時間內即使生長中止，因此可以減少很多被污染的機會。它的混濁度是以1.5公克相等的乾重量/每公升體積來對照使其標準化。
高密度的培養也可以利用置入發酵槽(fermenters)而得到，它是藉桶子的加熱來滅菌以及在原位的培養方式，配合自動溫控、酸鹼值和空氣控制裝置。會因熱而不安定的過濾設備液體是用過濾來達到滅菌效果，也可以內建於發酵槽。每批100公升的發酵槽最少可以產生66,000劑 (每一劑為 3 毫升)的油質佐劑疫苗(OAV)，如果它的密度比相當於1.5公克/公升，乾重量/體積的參考標準還高的話，可以製成更多的劑量。
油質佐劑疫苗(OAV)是以等量的輕礦物油和細菌懸浮液經過乳化而成，並且用5%的羊毛脂(lanolin)做為乳化劑。首先，將礦物油和羊毛脂滅菌，然後冷卻至40℃再加入0.5%的福馬林。緩緩加入細菌懸浮液，讓乳化作用繼續進行 10 分鐘。經過隔夜貯藏之後，這混合物再乳化一次，裝瓶後在使用前貯存於4℃可達兩週。
明礬沉澱疫苗(APV)之製備，首先是以上述參考標準來調整懸浮液之混濁度，它用等量含0.5%福馬林化的生理鹽水稀釋，調整pH到6.5，再加入20%熱的鉀明礬(potash alum)溶液使它配成1%的明礬濃度。在不斷攪動並放置隔夜之後，此疫苗即可裝瓶使用。
3. 過程中的控制
必須檢查的事項，有細菌最適當的成長濃度、細菌的莢膜化、培養的純度和不活化的效果等。
4. 分批管制
(a) 滅菌
無菌的測試和防止其它生物雜質污染的方法，可以參考第1.4章。
(b) 安全性
以抗體陰性的牛接種兩倍劑量疫苗之後，10 ~ 14天觀察有無不良反應。 以0.2毫升的疫苗用肌肉注射的方法，各接種於五隻小白鼠，並觀察五天。如果有小白鼠死亡的話，採取血液做病原菌的培養。
(c) 力價
力價的試驗可以採用以下任何一種方法：
(1) 用疫苗接種牛之後，採用病原菌直接攻擊的方式或是用牛血清在小白鼠體內做被動免疫保護測試。但這個方法並不十分可行，因為牛在接種油質佐劑疫苗(OAV)之後，需要很長時間才會產生適當的免疫能力。
(2) 疫苗接種兔子之後，再用病原菌直接攻擊的方式或是用兔子血清在小白鼠體內做被動免疫保護測試。 (3) 在小白鼠體內做力價測試，這是三種方法當中最可行的辦法。
50隻小白鼠每一隻都肌肉接種0.2毫升的疫苗，第14天時再接種一次。到了第21天，將小白鼠分成五組每組兩隻，每組都用不同稀釋濃度(10-1 ~ 10-10)培養6 ~ 8小時的野外菌株做病原菌的攻擊試驗，另外50隻對照組也做同樣的攻擊試驗，將所有的小白鼠觀察5天。為了得到能保護牛的劑量之正確參考指標，可以計算出它們的中等致死劑量(LD50)：用本方法所製備出來的疫苗至少有104單位的保護效果。
(d) 免疫有效時間
單一劑量的疫苗投與4 ~ 6個月大的仔牛時，用明礬沉澱疫苗(APV)可以有 3 ~ 4個月的保護作用，用油質佐劑疫苗(OAV)則有6 ~ 9個月的保護作用。
(e) 穩定性
油質佐劑疫苗(OAV)經乳化後，看起來一定要純白色，並且可以像漆一樣會粘著在玻璃上。如果和上述性質不符的話，必須將此疫苗丟棄。在表面上留下一油的薄層是正常的。它在4 ~ 8℃貯藏時，可保存6個月力價不會減低，但不能用冷凍方法保存。增加羊毛脂的含量可以增加其穩定性，但也會增加其粘稠度～這是它的一個明顯的缺點。如果使用其它的乳化劑，例如 "Arlacel"可以有助於產生較稀而穩定的乳化物。
(f) 投與方法
疫苗一定要用深層肌肉注射的方法投與。3 毫升的疫苗劑量建議使用 5 毫升的尼龍注射筒和 14 ~ 15 號針頭。
(g) 推薦的疫苗注射計劃
第一次疫苗注射的年齡是在4 ~ 6個月。例行的預防注射是在4 ~ 6個月大時，注射單一劑量的油質佐劑疫苗(OAV)，然後在3 ~ 6個月之後加強免疫一次。之後，每年再補強一次。如果實際上畜場的管理作業上無法在安排的時間實施個別的疫苗接種的話，則固定每年接種所有4個月以上的牛隻以及在六個月之後再接種所有一歲以下的仔牛。面臨疾病暴發時，先用一劑明礬沉澱疫苗(APV)接種後，再接種一劑油質佐劑疫苗(OAV)。
(h) 注意事項(可能的危險)
油質佐劑疫苗(OAV)如果滲漏到皮下組織時，偶而會在注射部位產生纖維性腫塊。如果消毒情形不確實時，有時會產生局部化膿的現象，但一般動物都具有相當的抵抗力，所以發生情形並非常見。明礬沉澱疫苗(APV)偶而會造成休克的情形。
5. 成品的測試
(a) 安全性
參考第B.4.b節。
(b) 力價
參考第B.4.c節。