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A. 診 斷 技 術

梅迪-威司奈病(Maedi-visna, MV)，或稱為綿羊慢性進行性肺炎(ovine progressive pneumonia, OPP)，是由有持續感染特性的lentiviruses感染所引起，該病和綿羊(sheep)及山羊(caprine)的關節炎/腦炎(CAE) 有很大關連。MV/OPP和CAE的特徵，是它的病毒會長期存在宿主的單核細胞 (monocytes) 和巨噬細胞(macrophages)內，以及在感染後產生抗體的時間上有很大的差異。大部份感染的羊和山羊都不會有臨床症狀，但會呈持續性感染的狀態以及長期傳播病毒。

梅迪-威司奈病(Maedi-visna, MV)的病名是源於冰島，它感染羊時包括兩種不同的臨床症狀。梅迪(Maedi)意思是 "呼吸急迫"，主要是由於進行性間質性肺炎(progressive interstitial pneumonitis)所引起，而威司奈(visna)意思則為 "畏縮"或 "衰竭"，它和腦膜腦炎所引起的麻痺有關。梅迪-威司奈病毒感染最主要的症狀是進行性肺部疾病，而CAE病毒感染則主要是引起慢性多發性關節炎(chronic polyarthritis)並伴隨有滑膜炎(synovitis)和滑囊炎(bursitis)。腦炎則主要發生於2到6個月之間的小羊。兩種症狀都會產生硬結性乳房炎(indurative mastitis)。

當懷疑是MV/OPP或是CAE病毒感染時，要根據它的臨床症狀、血清學及在需要時，採取適當器官做組織學檢查等方法來綜合判斷。需要採取的組織部位是肺臟做進行性間質肺炎的檢查，腦和脊髓組織做腦膜腦炎的檢查，乳房組織做硬結性乳房炎的檢查，感染的關節和滑膜做關節炎的檢查，以及採取腎臟做血管炎(vasculitis)的檢查。每個部位的炎症反應都很類似，它包括間質性單核細胞的反應，有時會聚集很多類淋巴細胞(lymphoid cells)和形成濾泡(follicle)。

1. 病原菌的鑑別

病毒分離和病毒的特性不常被用來做MV或CAE例行性的診斷。由於此病毒是長期性的感染，所以不難檢測出帶原動物體內的抗體。

有兩種方法可以分離出MV和CAE病毒：一種是用於活體動物，另一種則是用於屍解的組織。

　(a) 由活體動物的分離方法

˙梅迪-威司奈病毒 MV的前病毒（provirus）的DNA是可由循環的單核細胞和組織的巨噬細胞攜帶。所以要由活體動物分離病毒的話必須先製備白血球。要小心保持無菌狀態，從周邊血液，或由泌乳時從乳汁中收集並培養這些細胞，再加上所謂的指標細胞一起培養。指標細胞一般是取得羊脈絡叢細胞做培養。用無感染病毒的胚胎或初生仔羊來做第一次病毒培養，在經過3 ~ 4次繼代以後，大量地增殖病毒，最後用液態氮保存之。所收獲的羊脈絡叢細胞可以用共同培養的方式(co-cultivation)做10 ~ 15次的繼代。雖然繼代更多次以上時細胞仍可以繼續增加，但MV病毒的感受性可能會減低。

 製備白血球的方法可以從週邊採循環血液，用肝素乙二胺四醋酸或醋酸做抗凝劑，所採的血液以1,000 xg（離心力）離心15分鐘後，取其白血球層(buffy coats)。將這白血球層吸出後用Hanks'緩衝食鹽溶液(HBSS)配成懸浮液後，再一次用400g及加上合適的襯墊(例如Ficoll Paque[Pharmacia])離心40分鐘。 再一次用400g及加上合適的襯墊(例如Ficoll Paque[Pharmacia])離心40分鐘。 將這界面細胞用HBSS在100g離心清洗的方式洗一或二次，每次約10分鐘。最後將沈澱的細胞塊，用溶液配成濃度約10⁶細胞/毫升。取10毫升的懸浮液以逐步混合的方式，加入含洗過的羊脈絡叢單層細胞之 25 平方公分的角瓶裡。 乳汁中的白血球也可經由同樣的方式收集離心，並用離心洗淨再製成懸浮液之後加入到羊脈絡叢單層細胞裡。 含5%CO₂及在37℃下將它們培養，並視情況需要隨時更換培養基和繼代。培養中觀察它們的細胞病變現象(cytopathic effect, CPE)，它們的特徵是出現折射的星狀細胞(refractile stellate cells)並伴有樹枝狀的突出(dendritic processes)以及融合細胞(syncytia)的形成。培養過程必須放置數週之後，細胞確實沒有受到感染後，才可以將之捨棄。一旦發現有細胞病變出現時，應立即準備做蓋玻片上細胞培養之工作，由它們的培養固定和用免疫標示方法找出這病毒抗原存在的證據。標示方法可以用間接螢光抗體或用間接免疫過氧化酶(immunoperoxidase)的方法。另外，也可以將這形成病變的單層細胞培養液離心後，用電子顯微鏡觀察病毒是否有lentivirus的特性。在細胞培養的上清液中如果發現有反轉錄酶(reverse transcriptase)的話，可推論有反轉錄病毒(retroviruses)存在。

˙山羊關節炎/腦炎病毒

 分離CAE病毒的方法和應用在分離MV病毒的方法是一樣的。首先是取患有關節炎的山羊關節滑膜供CAE病毒分離。最適合分離白血球供病毒分離的樣本是周邊血液、乳汁和關節液。羊脈絡叢細胞(如上所述)適合作為指標細胞。另外也可以用山羊的滑膜細胞、胚胎的睪丸或角膜等來作為培養細胞。如果發現有細胞病變現象時可以用前面所述的方法來證實病毒的感染。

　(b) 由屍體解剖組織分離病原菌

˙山羊關節炎/腦炎病毒和梅迪-威司奈病(Maedi-visna)病毒 

 收集懷疑患病組織，如肺、軟骨、滑膜、乳房等，並用無菌技術將之切碎，放入含有滅菌之HBSS或細胞培養基的培養皿裡。個別的組織碎片用巴斯德吸管(Pasteur pipette)吸取後，每個25平方公分的培養角瓶內置入約25 ~ 30個組織碎片，並在每個角瓶內放入一些生長培養基。再將這些燒瓶培養在37℃含 5% CO₂的有溼度保溫箱內。靜置數天讓組織附著於瓶內。當細胞慢慢從碎片組織長出來之後，小心地加入培養基。在細胞長至足夠數量之後再加入胰蛋白酶（trypsin）消化下來，再分裝培養使成為單層細胞。並用共同培養的方法，檢查它們是否有形成細胞病變現象，以確認是否有病毒的感染。

 附著的巨噬細胞(macrophage)培養可以取自肺洗出物，並且在1 ~ 2週內用血清學、電子顯微鏡或反轉錄酶（reverse transcriptase)試驗的方法，來檢查病毒的生長情形。也可以用巨噬細胞和羊脈絡叢細胞如上所述白血球的共同培養方法來分離出病毒。

　(c) 核酸確認方法

 大部份病毒診斷實驗室都有細胞培養的基本配備。但如果在專業的研究實驗室，可以使用確認核酸的方法來鑑別病毒。以診斷MV和CAE病毒為例，這些方法是聚合酶 鏈反應、南方轉漬法（Southern blotting）和原位雜交(in-situ hybirdisation)等方法。所有用來偵測南方轉漬法MV和CAE病毒之前病毒(proviral)DNA的特異性核酸序列(sequences)的方法，都可以加以應用。如果用聚合酶 鏈反應診斷OPP和CAE病毒能普遍使用時，因為它可以彌補有些無法用血清學診斷出來的缺點，所以可以被用來作為疾病根除計劃的有利工具。

2. 血清學試驗

綿羊和山羊的lentivirus是有持續感染特性的，所以用血清學來檢查抗體的存在，是診斷帶原動物非常好的方式。MP和OPP病毒如果用多源抗血清(polyclonal antisera)則無法分辨它們之間的抗原性。但由於MV和CAE病毒的抗原性非常接近，所以分辨它們之間的異源性抗體(heterologous antibody)並沒有很好的效果。

最常使用的試驗是瓊脂膠體免疫擴散反應 (AGID) 和間接酵素結合免疫吸附試驗 (ELISA)。瓊脂膠體免疫擴散反應具有特異性和可重覆性高，並且操作簡單，但在結果判讀時需要經驗。間接酵素結合免疫吸附試驗非常經濟，而且一部份的操作過程可以自動化，因此可以檢查大量的血清樣本，不過這試驗的敏感度和特異性得依賴抗原的品質好壞而定。由於不容易製備高品質的MV/OPP和CAE病毒，所以間接酵素結合免疫吸附試驗無法作為例行的診斷工具。已經有許多間接酵素結合免疫吸附試驗的改良方法，例如用重組蛋白抗原(recombinant protein antigen)、雙抗體三明治試驗法(double antibody sandwich methods)和單源抗體法等。這些改良的方法在將來可使它在診斷的應用上變得更廣泛。但是一般來說瓊脂膠體免疫擴散反應仍是最普遍被使用的方法。

　(a) 瓊脂膠體免疫擴散反應(國際貿易上要求的試驗)

在血清學上有兩種最主要的MV/OPP和CAE抗原，一種是病毒鞘醣蛋白 (envelope glycoprotein) 一般稱為gp135，另外一種是核心蛋白(core protein)，我們稱之為p28。在抗原的製備中可以用培養基的方法來收集感染細胞和用聚乙二醇(polyethylene glycol)透析方法可以將它濃縮約50倍。經常使用的病毒株是OPP的WLC-1病毒株。

用瓊脂膠體免疫擴散試驗檢測抗CAE病毒抗體的敏感度，得視所使用的抗原而定。用CAEV gp135來做瓊脂膠體免疫擴散試驗會比用CAE病毒p28有較高的敏感度。另外，當用免疫沉降反應(immunoprecipitation assay)做比較時，瓊脂膠體免疫擴散試驗對抗CAE病毒抗體時CAE病毒抗原的敏感度比OPP病毒抗原的敏感度高35%。用來檢測抗CAE病毒抗體的CAE和OPP病毒抗原之間，在敏感度上的差異性，主要是因為免疫沉降試驗的抗體祗需要單一的抗原決定部位(single epitope)即可得到陽性反應，但是在瓊脂內的沉降反應則需要有多個抗原決定部位(multiple epitope)之抗體來作用才能成為陽性。雖然OPP和CAE病毒的抗原性非常類似，但相似到何種程度則仍不知道，因為在異源系統(heterologous system)反應時有較少的抗體/抗原反應。

在感染MV病毒的羊和感染CAE病毒的山羊在例行的檢查中最主要能使抗體沉降的是gp135抗原，而抗p28反應通常祗有呈現非常低的力價。

在有些CAE病毒感染的山羊，常會發現祗有抗gp135抗體存在，但卻沒有抗p28的反應，反過來說在其它的個體有些也祗有發現抗p28的反應而沒有gp135的反應。因此一個有效的標準抗血清必須能產生抗gp135以及抗p28的沉降線。

瓊脂培養基是用含0.7 ~ 1%的瓊脂醣(agarose)在8.0%氯化鈉調成pH7.2的0.05 M Tris 緩衝液所配製而成。這試驗可以在塑膠培養皿(plastic Petri dishes)裡或是在10公分平方的塑膠盤裡輕易地操作。以小孔的型式和大小來決定每盤受測試血清的數目。可以用各種不同型式的小孔配置，但最常使用的是六孔圍繞中央一小孔的配置方式。例如有一種型式是不同大(直徑5毫米)和小(直徑3毫米)的孔以間隔2毫米和距離中央直徑為3毫米的抗原孔2毫米的配置方式。大的孔是用來放置測試血清而這小的孔則是放置標準血清。每一盤裡一定要有弱陽性對照血清。塑膠盤放置在潮溼的密室並在室溫下培養隔夜後再檢查它們的沉降線。如果需要的話可以再培養24小時。

　(b) 酵素結合免疫吸附試驗

 有許多不同的酵素結合免疫吸附試驗方法。目前例行診斷中，最實用的是以純化的全病毒作為抗原的間接酵素結免疫吸附試驗的方法。Simard和Briscoe曾提出一個比瓊脂膠體免疫擴散反應更為簡單並且敏感度更高的方法。它的抗原是用不同速度離心而成，感染細胞的上清液經過清潔劑（detergent）處理，並用來覆蓋微滴定盤。反應劑按以下順序置入：

(1)測試血清；

(2)過氧化酶 結合的兔抗羊免疫球蛋白；

(3)呈色劑（colour developer）。

每個階段之間用特別的培養時間、溫度和洗淨方法。必須包括陽性和陰性對照，並且以分光比色計（photometer）來測它們的吸光度。

商用的酵素結合免疫吸附試驗套組（Bommeli）是用全病毒抗原來檢測CAE病毒抗體。這個酵素結合免疫吸附試驗方法也可以用來檢測乳汁液樣本，但是假如乳中的lentivirus 抗體力價很低的時候（可能祗有血清中的 10%）它的敏感度也會變得很低。

B. 疫苗和診斷用生物製劑之條件

　　沒有可以使用的生物製劑產品。