馬立克病 ( Marek's Disease )

馬立克病 (Marek's disease, MD)為一種雞的淋巴腫瘤及致神經病變疾病，較少發於火雞及鵪鶉，其致病原為疹病毒 (Herpesvirus)。根據臨床病症，大體及顯微病變加以診斷此病。雞隻感染馬立克病病毒並不一定呈現臨床症狀，但病毒感染可利用病毒分離或病毒抗原與抗體的反應來加以偵測。

MD 的預防為利用不同病毒型別的單價或多價活毒疫苗對剛孵出小雞隻進行免疫。

於雞隻的感染，馬立克病好發於 12～24 週齡雞隻，但對 6 週齡至成雞亦均有感受性。腿及翼的痲痹伴隨有周圍神經的腫脹為典型的病症特徵，但有時病變並未涉及神經，尤其是在成年個體。隨著病毒不同毒株的感染，特別是在卵巢、肝、脾腎、肺、心、前胃及皮膚可見淋巴瘤樣病變。在組織學上，神經的淋巴球浸潤及淋巴肉瘤經常含有各式不同的淋巴細胞。此外、MD 與淋巴白血病 (lymphoid leukosis) 兩者的鑑別診斷是相當重要的。

病原的鑑定︰在現場，大部份的雞隻於出生數週感染 MD 病毒，然後終其一生成為保毒個體，通常並不會發展成明顯的病症。這類的感染通常可藉分離個體的血沈棕黃層 (buffy coat) 細胞接種雞腎細胞或鴨纖維芽細胞，數天後可看病毒斑 (plaque) 的形成。MD 病毒有兩種血清型被加以確認，分別為 1 及 2 型，第 3 型血清型則與火雞相關疹病毒 (HVT)。MD 抗原可以在其羽毛尖端以放射性沈澱素反應 (radial precipitin test) 加以偵測。

血清學測試︰抗 MD 的抗體通常在感染 1～2 週後產生，抗體的偵測及確認一般以膠內免疫擴散 (agar gel immunodiffusion) 進行反應，有時亦以其他血清學方法來進行偵測。

典型的 MD 其最常見的臨床病徵為腿部及翼部的局部或完全痲痹。而在急性型，感染病禽通常可見極度抑鬱及甚至並無出現任何症狀即死亡。

典型的 MD 中具特徵性的發現為一至數條周圍神經 (peripheral nerve) 的腫大。這些通常在死後剖檢時最容易見於翼神經叢、坐骨神經叢、腹腔神經叢、腹腔迷走神經及肋間神經等。變性的神經通常腫至正常的 2～3 倍大，正常時所見的橫斷面橫紋及閃亮光澤消失，外觀可能呈現淡灰或淡黃色﹐有時甚至水腫。淋巴瘤有時見於典型的馬立克病，以卵巢中形成質軟灰色的小腫瘤最常見，但有時在肺、腎、心、肝及其他組織亦可發現。

在急性型；具特徵性的病變為迷漫性淋巴瘤的轉移，涉及臟器包括有肝、性腺、脾臟、腎、肺、前胃及心。有時淋巴瘤也在骨骼肌或羽毛濾泡周圍附近的皮膚發生。感染的病禽有如同典型病型的神經腫大。於年輕病禽其肝臟呈中度腫大，而成年病禽的肝臟則如同淋巴白血病所見呈較大腫大。但神經的傷害往往不見於成年病禽。在急性型及典型 MD 中﹐疾病發生始於淋巴細胞的增生，增生的形式可能在某些為發展性增生而在其他則為退行性增生。周邊神經所受的影響可能為增生性 (proliferative)、炎症性 (inflammatory)、中度浸潤性 (minorinfiltration) 的變化而分成為 A 型、B 型及 C 型病灶。A 型造成的病灶包括有增生性淋巴母細胞、大中小型淋巴球、巨噬細胞的浸潤，特性上均為增生性的。B 型造成的病灶則以特徵性的神經內水腫、小型淋巴球及漿細胞的浸潤、許旺氏細胞的增生；特性上屬炎症性反應。C 型病灶包括有常見於無大體病變及臨床症狀的病禽可見到的小型淋巴球散佈。這種病灶被認為是進展性的發炎反應。而脫髓鞘通常發於 A 型及 B 型，並造成臨床上所見的痲痹。

於內臟器官或其他組織所見的淋巴瘤和 A 型於神經所造成的淋巴增生在細胞形態上是類似的。通常這些淋巴細胞增生都是混合多樣的，其中又以小中型淋巴細胞為最多；有時，特別是在成年急性的病例中可見多數的大型淋巴細胞及淋巴母細胞。這種在淋巴瘤所見的異源性(heterogenous) 淋巴細胞族群，可用蘇木紫伊紅 (haematoxylin eosin) 染色及淋巴瘤壓片 May-Grunwald-Giemsa 染色並可與淋巴白血病加以區別，因淋巴白血病所見的為單純 (uniform) 淋巴母細胞的浸潤。另外一個重要的區別為於淋巴白血病中，淋巴瘤發生於華氏囊且為內濾泡原生性並有增生的情形。在 MD 雖然有時華氏囊亦有淋巴增生發生，但腫瘤在所在位置處較不明顯、呈擴散及濾泡間增生性等。周邊神經的傷害在淋巴白血病中並不如 MD 般為病變的特色。兩者間主要的區別如表一所示。在區別成年禽類的 MD 與淋巴白血病時最大的困難在於 MD 有時有淋巴增生性腫瘤伴隨肝臟腫大而無神經病變的情形發生。這裡有必要再對特異性的檢測技術進行分類，例如免疫螢光 (immunofluorescence) 可偵測 MD 的 T 細胞抗原、MD 腫瘤細胞的腫瘤表面相關抗原 (MATSA)、或淋巴白血病的 B 細胞抗原、腫瘤細胞的免疫球蛋白 M (IgM) 等。無論如何，如果有數隻感染病禽可做死後解剖，診斷可以大體病變及組織病理來進行判定。

神經病灶不論在大體病變及組織病理上，均與某些網狀內皮增殖症病毒（reticuloendotheliosis virus）所造成的淋巴瘤性增生類似。雖然網狀內皮增殖症病毒於禽類並不常見，但必須牢記因它亦為淋巴性腫瘤一可能的因素，其診斷須依賴族群中病毒學及血清學的檢測。網狀內皮增殖症病毒 (reticuloendotheliosis virus) 雖然禽族群中可能出現陽性反應但卻很少出現增生性疾病。
並無發現在研究 MD 病毒及相關的火雞疹病毒 (HVT) 時有任何健康上的風險。

1. 致病原的確認 (Identification of Agent)

可從感染雞隻的組織中進行病毒的分離而偵測到 MD 病毒。一般採用的檢體為病雞的肝素抗凝血液樣本中的血沈棕黃層 (buffy coat) 細胞或淋巴瘤細胞、脾臟細胞的懸浮液。因 MD 細胞為強烈細胞附存性 (cell associated) 故這類細胞懸浮液必須要含有活存細胞。將細胞懸浮液接種至單層雞腎細胞或鴨胚纖維芽細胞〔雞胚纖維芽細胞對病毒初代分離（primary virus isolation）較不敏感〕。血清 2，3 型 MD 病毒在雞胚纖維芽細胞比在雞腎細胞中容易分離（見 Section B. 1. a） 。通常以 0.2 ml 含10⁶～10⁷ 活細胞的細胞液接種至塑膠的細胞培養盤（60 mm 直徑）。接種與未接種的對照組置於 38.5 ℃，5 % CO₂ 的保溼培養箱中進行培養。其他密閉的細胞培養容器亦可使用。培養液每 3 天須更換一次。產生細胞病變 (CPE) 的區域，稱之為斑 (plaque)，會在約 3～4 天時出現，在大約 7 天時加以計算。

另外較不常用於 MD 診斷使用的病毒來源為毛囊尖端 (follicular tip)，無細胞依附之馬立克病病毒可自此地方加以萃取分離。取 5 mm 的尖端或絞碎含尖端通道的皮膚樣本，置入含 SPGA-EDTA (sucrose, phosphate,glutamate and albumin-ethylene diamine tetra-acetic acid) 緩衝液來萃取及滴定無細胞依附的 MD 病毒 (cell-free MD virus)。緩衝液內配方組成如下：0.2180 M sucrose (7.462 g)；0.0038 M monopotassiumphosphate(0.052 g)；0.0072 M dipotassium phosphate (0.125 g)；0.0049 ML-monosodium glutamate (0.083 g)；1.0 % bovine albumin powder (1.000 g)；0.2 %EDTA (0.200 g)；and distilled water (100 ml)。

緩衝液以過濾器過濾消毒並將 pH 值調至 6.5。懸浮液以超音波震盪後以 0.45 um 濾膜加以過濾後，接種至一日齡單層雞胚腎細胞。先經 40 分鐘感作後加入培養液如上述進行培養 7 天。

使用這些方法，MD 病毒血清型 1 及 2 型可能一起和 3 型 (HVT) 被分離出（如果是進行免疫的結果）。依據經驗顯示不同血清型別的病毒所造成的病毒斑可以依據病毒斑 (plaque) 的形成時間、形成速率及形態學特徵加以分辨。HVT 形成的病毒斑出現較早且比血清 1 型大，而血清2型病毒斑則比血清 1 型較晚出現且較小。

聚合鏈鎖反應測試己被應用於血清 1 型病毒的致腫瘤與非致腫瘤病毒株分別，以及血清 2 及 3型的疫苗株。


2. 血清學試驗 (Serological Tests)

　　4 週齡雞隻如有發現 MDV 的抗體表示有感染發生。在這年齡之前的抗體出現可能表示來自卵黃囊的母體移行抗體而並不能當成主動感染的證據。

　　通常病毒、抗原及抗體可自 OIE 的馬立克病參考實驗室中取得，但並不提供標準化反應試劑。

　　膠內免疫擴散 (Agar gel immunodiffusion，AGID) 反應並無商品化的試劑，但此試驗為最常用來測試有無抗體。此試驗以覆蓋含有 8 % 氯化鈉 (sodium chloride) 之磷酸緩衝的 1 % 洋菜明膠載玻片進行。相鄰的孔分別注入抗原或血清然後令其在保溼狀態下，37 ℃ 下進行擴散 24 小時；陽性血清會表現出與已知陽性血清或抗原一致性的反應。使用的抗原不是 MD 病毒感染的培養細胞就是羽毛尖端的萃取物，或是自 MD 病毒感染雞隻取下的含羽毛孔道的皮膚。

試驗步驟 (Test Procedure)

1. 以 8 % Sodium chloride 溶液配置 1 % Difco bactoagar，將此混合物置於沸騰的水槽。
2. 吸取 4 ml 的洋菜明膠溶液在 7.5×2.5 cm 顯微鏡載玻片上令其凝固。
3. 載洋菜明膠上用鑿孔器進行挖孔，孔之直徑應為 5 mm，彼此間距為 2 mm，以吸引針吸去洋菜明膠塊。
4. 吸取測試血清於上排及下排的孔道中，而標準陽性血清或抗原則置於中間列。
5. 將載玻片在潮溼培養皿、37 ℃ 下作用 24 小時，之後在暗室利用燈光進行結果判讀。

AGID 的方法可變通來偵測在羽毛尖端的病毒抗原而作為感染病毒的一種指標。

玻片覆以 0.7 % 洋菜（在 8 % sodium chloride，並含馬立克病病毒抗血清）。
取自雞隻的小羽毛尖端樣本垂直置入洋菜，如上述進行作用。若在羽毛間周圍出現放射狀沈澱線表示羽毛內含 MD 病毒抗原，亦表示感染發生。

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