牛 流 行 熱 ( Bovine Ephemeral Fever )

        牛流行熱是由桿狀病毒科 (Rhabdoviridae) 的流行熱病毒感染所引起，是由吸血性節肢動物傳播的急性傳染病。發病時呈一短暫的高熱 (41～42 ℃)、精神沉鬱、呼吸急促、四肢僵硬及跛足等症狀。往往造成流產、產乳量下降、治療費用極高及治療後抗生素殘留乳的廢棄甚至死亡或淘汰等經濟損失。本病於 1906 年在南非首次發表，但本病早在 1867年在非洲就曾經記載發生過，本病現存在的地區有非洲、亞、澳洲及日本等熱帶、亞熱帶國家。引起牛流行熱的桿狀病毒是單股 RNA 病毒，病毒顆粒呈子彈形或是桿狀而名之，病毒顆粒直徑為 70～80 nm，長 90～180 nm，有的呈 185×75 nm 之圓錐型或子彈的病毒。牛流行熱病毒感染的動物有乳牛、黃牛、水牛，甚至鹿也有類似病例。本病是由吸血昆虫所傳播，而由 Key (1975) 及 Standfast 等 (1973) 以試驗証實本病毒會在蚊子或糠蠓體內增殖，Davis 及 Walker (1974) 在肯亞從糠蠓及 St. George (1976) 在澳洲從蚊子身上分離到本病毒，由此顯示本病的傳播與吸血昆虫有關。又據 Murray（1970）報告，本病傳播之方向與風向極一致，而主張本病之發生，係由帶毒之吸血昆虫乘風傳播而成為感染源。本省因位處亞熱帶氣候型區，吸血蚊虫在牧場中容易孳生，因此牛流行熱疫情在本省已爆發四次，也造成酪農的重大損失，因此加強牛流行熱的預防接種是極為重要，讓牛隻隨時能保持高抗體以防禦野外病毒感染。

        病原的證實：在急性感染期可採取患牛血液進行病毒分離，分離用的細胞可以 BHK-21、Vero 或 C6 / 36 株化細胞。本病毒接種 BHK-21、Vero 細胞 3～4 天後會致細胞產生病變，然後取細胞上清液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒。然後病毒可由中和試驗確診，或由單株抗體染色感染細胞確診。血清學的抗體檢測方法，最常用的是病毒中和試驗。

一、診斷技術

        本病為一種急性、熱性傳染病，經過 3～8 日的潛伏期後會呈現一短暫性發熱，且出現呼吸器障礙，有時併發消化器異常等症狀，若臥地時間太久，又沒有對四肢作適當之保護，則其關節會因受傷而呈現異常。初發病時，在發熱前常見皮肌（如背肌、後軀幹肌）有寒慄，但輕症時不易發覺。發熱為本病必有症狀，體溫會突然升高至 41～42 ℃，稽留 1～2 天，最長 3～4 天後就會下降。在發熱同時眼睛流淚，眼瞼附著分泌物，結膜充血及浮腫，鼻鏡呈乾燥狀態。呼吸器障礙為本病之特徵，臨床症狀是突然發熱、呼吸急促、呼吸數增加（70～110 次 / 分），有些病牛因呼吸困難而伸出舌頭、張口呼吸，病牛呻吟呈現苦悶狀。由於病毒的感染在氣管引起炎症反應，而致氣管的症分泌物增加，由於氣管受多量泡沫性粘液所致而發生肺氣腫，因而在病情較嚴重時會導致窒息死亡。

        臨床症狀上，病牛會由咽喉頭及支氣管發出極為粗厲呼吸音，從遠處也能聽到此種異常之呼吸音。肺部聽診有高調尖銳肺泡音，並有咳嗽。其發病後食慾不振或廢絕，反芻停止，至退熱後才恢復正常。第一胃停止蠕動，因胃鼓脹或缺乏水份致胃內容乾凅，有些病牛腸之蠕動亢進，也有停止蠕動者，糞便如羊糞呈便秘，亦有排泄軟便及下痢便。大部份病牛因肌肉壞死疼痛而引起跛行或不能起立，屈膝而倒臥地面。泌乳牛在發病時乳量銳減，有時泌乳停止，且因為治療時使用抗生素致要恢復正常應乳約須一個月之久，經濟損失極大。其它尚有皮溫不整、角根、耳翼、肢端厥冷亦為本病的早期症狀，此可供本病早期診斷之參考。病牛鼻鏡雖乾燥，但病牛不斷流出水樣鼻液、鼻翼擴張、粘膜潮紅，又因口內發炎，流涎甚劇而致口角周圍附著多量泡沫。尿液因發熱而減少，並排出呈混濁尿液。懷孕母牛因發熱或較嚴重者，則發生死流產的情形。

        病理病變主要於肺臟及上呼吸道。在急性感染的死亡病例往往是因為急性肺氣腫及肺充血而窒息死亡，解剖病變可見咽喉頭及氣管等上呼吸道粘膜呈現充出血，肺腫退縮不全（不能伸縮），肺含多量氣體，呈間質性氣腫，較顯著病例形成如一大氣囊，氣腫有時波及橫膈膜、頸部、下腹部之肌間或皮下。肺也會出現水腫及充血，各肺小葉實質可見局限性暗紅色，如斑狀之肝病灶。支氣管充滿黃白色黏液。心外膜針頭大至粟粒大出血點。肝、脾、胃等實質臟器有輕度腫脹及小壞死灶。消化道並無顯著病變，但粘膜有時可見充出血，尤其在第四胃、盲腸粘膜有漏出性出血。淋巴節呈腫大，腦呈充血並有水腫性病變，關節囊內黃色關節液增加。

病原診斷

樣品採集與處理

        病材應採發病牛隻的抗凝血液約 10 ml（可添加肝素或是採集脫纖血），以冷藏方式運送到實驗室後，血液先經 1,000 g 離心 5 分鐘，分離出血球液及血漿，經分別收集血漿後，血球部份加入經高壓滅菌過的磷酸緩衝溶液 (PBS) 至原來的採集量。經以搖晃混合後再經前述的離心方式，將上層的 PBS 溶液去除。之後再以 PBS 溶液如上述方法清洗血球液 3 次後，再以 PBS 還原為原來全血容積，經混合均勻後分裝再置入 －80 ℃ 冷凍保存供病毒分離。若有發病牛經剖檢後也可採集其肺、氣管、脾等各臟器以細胞培養液，製成 10 %（W / V）乳劑，經 1,500 g低溫離心 20 分鐘後取上清液保存，供病毒分離用。

病毒分離與同定：

         病毒分離之診斷是以上述的病材接種繼代細胞如：BHK-21、Vero 等株化細胞。培養的方式是細胞以 25 cm\P2\P 角瓶增殖成單層細胞後，再接種 0.5 ml 的病材進行吸著反應一小時。然後再加入細胞培養 3 ml 後，置入 34 ℃ 恆溫箱中培養，第一代的培養往往無病毒增殖的現象，往往須經過 2 至 3 次繼代才會顯現病毒增殖的病變，如有病毒增殖會形成細胞病變 (CPE)，可取病毒液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒。或是以牛流行熱免疫血清作病毒鑑定。關於病毒的分離也可以上述的病材以出生一日齡小老鼠做腦內接種，接種的老鼠若死亡或是呈現神經症狀，可將老鼠冷凍後，取出腦製成腦乳劑，以 4 ℃ 2,000 g 離心 20 分鐘後，取上清液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒。以細胞進行病毒分離的方式如下：

以 25 cm\P2\P 培養角瓶培養好單層細胞，再每瓶以接種 0.5 ml 樣品液到細胞上。34 ℃ 感作 1 小時。去除接種樣品液，以 3 ml 維持液將單層細胞洗 2 次，再加入 3 ml 維持液至 培養瓶，然後放入 34 ℃ 恆溫箱培養觀察。

        本試驗需含有 BEFV 陰性與陽性的對照，但必需非常小心不可污染到正常的試驗。可在最後才操作陽性對照，並且使用不同的細胞培養角瓶。顯微鏡下每天觀察是否有 CPE，若有 CPE 則再用牛流行熱標準血清做中和試驗或免疫螢光法來確認。若 7 天後仍無 CPE，培養細胞以 －70 ℃ 冷凍、再解凍、離心取上清液，接種新的單層細胞。若 2 次繼代後 7 天仍無 CPE，樣品則可認為是陰性血清學診斷牛流行熱的血清學診斷方法以中和試驗為主，將牛隻發病時的血清採集後，經過 10 至 15 天再採集發病牛隻血清，進行中和試驗檢查，以中和抗體力價升高 4 倍以上判定為牛隻感染牛流行熱。實施中和試驗的方法如下：

試驗用病毒保存：

        測試中和抗體之前先要準備一批試驗用病毒，先小分裝保存於 －80 ℃ 冰箱中，待每次進行中和試驗時取出稀釋使用。並於每次使用前先測試其病毒力價，以病毒力價達 10\P5\P TCID\B50\B / ml 方可供為中和試驗使用。

血清的處理：

        將採集的牛隻血清經分裝保存於 －20 ℃，於血清測試前，須先經非動化的處理，方法是將已溶解回溫的血清放置在 56 ℃ 水浴槽，靜置 30 分鐘後，以去除非特異反應因子，然後供為中和試驗用。

中和試驗的實施：

        以細胞培養液做血清的 2 倍序列連續稀釋，取 96 孔微量培養盤將血清從原液稀釋至 1024 倍，每個稀釋倍數至少做 2 孔，每孔 0.05 ml。陽性、弱陽性、陰性血清之序列稀釋液亦需與試驗樣品一同操作，另加一組為未加稀釋血清做毒性對照。

        每孔加入 0.05 ml 含有 100 TCID\B50\B 的 BEFV，在毒性對照孔則以培養液取代病毒液，細胞對照則是不加樣品血清不加病毒而加 0.1 ml 之培養液。

        將殘餘的病毒原液以培養液做 10 倍序列稀釋至少 4 個梯度，每孔使用 0.1 ml，並且每稀釋倍數最少做 4 孔供力價回歸測定。將培養盤置於 37 ℃ 感作 1 小時。每孔加入 3×10\P4\P 細胞 / 0.1 ml 的細胞懸浮液 0.1 ml。將培養盤置於 37 ℃ 培養 3～5 天。

        從顯微鏡下觀察 CPE，並檢查病毒的回歸力價測定是否為 100 TCID\B50\B（30～300 log\B10\B TCID\B50\B 均可接受）、檢查血清對照、細胞對照。陽性血清對照應在 2 倍序列稀釋的± 1 稀釋度範圍之內（±0.3 單位），弱陽性對照檢驗結果應為陽性，陰性血清應該沒有中和力價，在細胞對照其細胞應完好不變。

        血清的力價以可完全中和病毒的血清稀釋倍數之倒數表示。為了定性，任何力價高於 1 可判為陽性，若血清對照顯示有毒性，則樣品判定為沒有結果，而須重新測試，或血清重新採集一次以供測試，這樣的情形在血清抗體力價高時可用更高的稀釋度做血清毒性對照再來判定。

病理學診斷

牛流行熱感染之牛隻病理學變化，主要在肺臟呈明顯之肺氣腫變化，肺小葉間膈擴張，大量嗜中性球浸潤於支氣管，肺泡極為擴張而破裂融合成一大空洞，上皮及周圍組織，肺小葉間膈擴張，部份肺組織因擴張壓迫變形，在急性期感染過的牛隻於耐過後可在四肢有關節炎的病理變化。

二、確診依據

目前本病的診斷依據是以病牛的病毒分離為主，尤其牛隻在呈現體溫上升時的病毒分離率較高。而對發生牛群的配對血清檢查中和抗體反應，若發病後抗體力價較發病初的力價有 4 倍以上的升高也可判定是有牛流行熱病毒感染，此也可為診斷依據。

三、參考文獻

邱仕炎、呂榮修 (1987) 牛流行熱預防的研究。中華民國獸醫學會雜誌，13：189－185.

呂榮修、李永林、黃士則、蔡向榮、廖永剛、林地發、曾俊憲、邱仕炎（1992）1989年發生在臺灣的牛流行熱疫學研究。臺灣畜牧獸醫學會會報，60：51－56.

Chiu S. Y. and Lu Y. S. (1987) The epidemiology of bovine ephemeral fever in Taiwan 1984. J.Chinese Soc. Vet. Sci., 13：1－9.

Davis S. S., Gibson D. S. and Clark R. (1984) The effect of bovine ephermal fever on milk production. Aust. Vet. J., 61：128.

St. George T. D (1985) Studies on the pathogenesis of bovine ephemeral fever in sentinel cattle. I. Virology and serology. Vet. Microbiol., 10：493－499.

St. George T. D. and Standfast H. A. (1988) Bovine ephemeral fever. In：Thomas P. Monath(Ed.) The Arboviruses：Epidemiology and Ecology Vol. II Chapter 17, CRC Press, Inc.Florida, U. S. A. pp. 71－86.