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第四章　細菌培養法

建立日期
96年01月10日
更新日期
96年01月10日
內容
4.1. 前言
  　　依試驗目的之不同，需選合適之培養條件。培養細菌之目的不外為 (1) 是否從不純材料中探討特定的細菌，(2) 是否要調查材料中所有一切細菌。(1) (2) 均係分離培養。(3) 是否對已知性質之一種細菌之培養 ( 純粹培養 ) 等，依檢查目的而選擇適當之培養基進行培養試驗。
   
4.2. 分離培養之預備操作：
 
(1) 增菌法：接種被檢材料於增菌培養基，除助長目的菌之增殖之外，尚能抑制雜菌之增殖，然後在平皿瓊脂行分離培養，如 Salmonella 之 Selenite Broth，YCC Broth 等。
(2) 通過動物法：如肺炎球菌、破傷風菌之小白鼠接種，或結核菌之天竺鼠接種等均是最佳實例，除在動物體增菌外並兼藉以動物體過濾分離，本法幾乎或完全能達成純粹培養之目的。
(3) 加熱法：利用一般芽胞對熱頗具扺抗性之特性，而自無芽胞細菌分離芽胞細菌之方法，如經 80℃ 15分鐘加熱時，一般發育型之細菌會死滅而殘留芽胞。此法多用於厭氧性細菌分離之用。
(4) 化學的集菌法：利用目的菌對某種藥劑有強扺抗性之特性，如結核菌常用 NaOH 或硫酸，Mycoplasma 用醋酸鉈等。
   
4.3. 平皿分離培養法：
  　　若干程度稀釋之檢查材料培植於平皿培養基，對個別之細菌形成獨立菌落之方法。本方法先以觀察菌落之特徵、菌之形態，平板法凝集反應選出目的菌，供為移植純粹培養。
 
(1) 瓊脂平皿之製備：
  加熱滅菌融解之普通瓊脂或 Trypticase soy agar 等以無菌方法倒入滅菌之平皿 15~20ml，使之凝固，凝固後稍開皿蓋放置無菌室或恆溫箱，使其皿內之水蒸氣及瓊脂上面之凝固水發散。如能使瓊脂降低溫度至 50℃ 前後，才倒入平皿並稍開皿蓋效果更佳 ( 圖 4.1，A 或 B)
  如平皿瓊脂過於薄層 (15ml 以下 ) 即易裂開且操作不方便，又所形成之菌落較小。一般在恆溫箱放置 2 小時後，倒置培養基收入塑膠袋並密封後放在冰室，使其瓊脂更乾固後使用之 ( 圖 4.1，C) 。
(2) 平皿培養基塗抹培養法：
  在 37℃ 恆溫箱內稍為加溫之平皿培養基蓋子為下方一手拿平皿，手指不可觸及平皿之緣口，手腕稍朝上彎，以白金耳從平皿瓊脂上端密劃塗抹後依序向下劃線，以此方法可遞減稀釋菌落，劃線有幾種方法，如菌量過多可抹 1/3 或 1/2 之後，然後鉤上已劃之少部分菌落，依序劃下，劃線培養時，白金耳與平皿之角度固定，並以一定之速度及壓力塗抹，不得重疊劃線塗抹之 ( 圖 4.2、4.3)。
  由斜面瓊脂吊取菌落在平皿培養基做純粹培養，( 圖 4.4) 或由平皿培養基挑選獨立菌落繼代轉移於斜面時，( 圖 4.5) 亦皆以同一要領實施。
 
 
圖4.1 瓊脂平皿之製備，瓊脂凝固後稍開皿蓋使水氣蒸發 (A 或 B) 後，倒置培養基在 4℃ 保存
圖4.2 平皿培養基之塗抹培養法。
 

圖4.3 平皿培養基之塗抹培養法。
A. 於一端畫線塗抹一半後，一端再塗抹分一半瓊脂
B. 在一端先濃厚塗抹畫線後再塗抹上半部瓊脂之其他部分，然後再由另一端畫線塗抹。
C. 直接由一端畫線塗抹整個平皿瓊脂。
D. 由一端畫培養約半個瓊脂面後，再以垂直角度交叉於已畫線之末端後再塗抹於另一半瓊脂表面。
 
 
1. 接種環火焰滅菌後冷卻
 
2. 除去裝有標本菌之試管的蓋子
3. 標本菌
4. 將試管蓋蓋上後將試管置於一旁
5. 掀開平皿蓋子在部份瓊脂上畫線
 
6. 接種環火焰滅菌後冷卻
7. 交叉畫線
8. 火焰滅菌
9. 與第二次畫線部份交叉畫線於其他未畫線區域
10. 置入恆溫箱培養
圖4.4　平皿培養基之塗抹法。
 
 
1. 檢查細菌培養基選擇要轉移之菌落
2. 接種針火焰滅菌後冷卻
3. 以接種針接觸所選擇之菌落
4. 將接種針沿斜面表面往上畫線接種。接種針火焰滅菌。斜面培養。
圖4.5　純粹培養菌之繼代。
 
(3) 斜面分離培養法：
  使用斜面瓊脂，本法亦可應用於細菌之分離培養，此時不可觸及凝固水之部分，並使用3支以上斜面試管瓊脂依次劃線稀釋培養。
(4) 探討目的菌：
  注意菌落之性狀、顏色、培養基之變化，檢查可疑菌落以玻璃鉛筆做記號做染色，或行試探性凝集反應後把最有可能之菌落移作純粹培養，供為以後同定之用。
   
4.4. 嗜氣性菌之純培養法：
  　　一般認為一個菌落係由一個細菌所發育增殖而來，因此純粹由一種細菌所構成，所以取自一個細菌所培養者謂純粹培養。
  　　左手指斜拿新舊培養基試管下面 1/3處，以右手先把棉花塞或橡皮塞扭轉使其鬆弛後，再以右手小指頭取棉花塞或橡皮塞，以火焰滅菌管口後，右手拿白金耳在火焰 ( 還元焰處 ) 中燒紅，同時白金耳把持之金屬部分亦需通火焰，然後插進舊培養基管壁使其冷卻 ( 或在新培養基凝水裏冷卻亦可 ) 後，採取少量之菌落插入新培養基凝水裡混合，然後在新培養基由下向上劃一直線，再以該線為中心由下向上劃曲線。純粹培養多劃以一條直線或曲線，使用後之白金耳須在火焰中滅菌。
  　　高層培養基之培養方法，即以白金線沾許微量細菌由新培養基之中心向管底穿刺培養。
  　　半斜面培養乃斜面與高層所組成，其培養法即先穿刺高層後再塗佈於斜面全部 ( 圖 4.6 )。
4.4. 1. 瓊脂斜面 (Agar Slants)： Trypticase Soy Agar
 
4.4. 2. 液體培養基：
  　　Thioglycollate Medium，未加指示劑 135℃
 
4.4. 3. 半固體培養基：
  　　CTA Medium with Dextrose
 

圖4.6　試管培養基之接種法。
   
4.5. 厭氣性菌培養法
  　　厭氣性菌係指在普通氧氣之狀態下，發育不佳或完全不會發育之細菌而言，有些細菌降低氧氣分壓才能發育旺盛，但有些細菌不要氧氣之分壓，反而有二氧化碳存在時為發育之必要條件 (CO2 依存性 )，如Brucella, Hemophilus, Leptospira 均屬 CO2 依存性。
  　　又依菌種如大腸菌不管在嗜氧性或厭氧性之下皆不影響其發育，此種細菌統稱為通性厭氧性菌 (Facultative anaerobe)。
  　　但如降低空氣中氧分壓時，完全無法發育如 Bacterium　anitratum，更有如 Bacteroides 、Clostridim 之某種如 Bifidus 菌，如少許氧氣時發育即抑制，此種細菌被稱為偏性厭氧性。
4.5. 1. 液體培養基之厭氧性培養法：
  　　使用 Cookde meat medium ,Brain heart infusion broth，腦心培養基，Thioglycollate medium ，肝片加肝臟 Broth 等，均分裝於中試管內約 8ml，以高壓滅菌或者沸滅菌先驅逐氧氣後使用之，一般厭氧性菌均能發育。
4.5. 2. 空氣置換法：
  　　使用鐵槽厚壁之玻璃槽內放進培養基後，以真空幫浦除去槽內之空氣，或再加氫氣。
4.5. 3. 化學的氧氣吸收法：
  　　Shotensack 之方法：利用焦性沒食子酸與碳酸鈉混合物，吸收氧氣之原理使厭氧性菌能發育。
  　　方法：
(1) 被檢材料培養於葡萄糖加血液瓊脂內。
(2) 棉栓之上部以剪刀切斷，塞入管內但不要觸及瓊脂，上面放置脫脂綿之薄層。
(3) 結晶碳酸鈉以乳缽研磨後加等量之焦性沒食子酸，兩者馬上混合，用玻璃紙包好放置小管內放入棉花上面，管口塞以橡皮塞並封蠟後收入恆溫箱培養。
4.5. 4. 二氧化碳培養法：
  　　應用於布氐桿菌、肺炎球菌、嗜血桿菌、髓膜炎菌、釣端螺旋菌、乳酸菌、Campylobacter 等。
 
(1) 蠟燭法：玻璃乾燥器 ( 玻璃容器 ) 內置培養基，其上面置空平皿一張，豎起一根蠟燭，點火後在玻璃蓋接口處塗上凡士林然後密蓋後俟蠟燭火焰消失，此時氧氣被消耗而 CO2 之分壓至 4% 左右時火自然熄滅，但此法對要求較多厭氣性或 CO2 嗜好性菌者殆無法發育。
(2) 二氧化碳置換法：附有吸引瓣玻璃乾燥器，量其容量後加蓋以真空幫浦吸引裏面適當空氣後，再注入相當於容積 10% 之 CO2
   
4.6. 偏性厭氣性菌培養法
4.6. 1. Steel wool 法：
  　　1.0% 之硫酸銅液 ( 以濃硫酸修正 PH 為 2.0) 加 Tween 80 成為 0.25%，假如使用 3,000ml 之玻璃乾燥器時，以 40℃ 加溫之 Tween 80 加硫酸銅溶液 500ml 加浸 10g 之 Steel Wool 約 30~60 秒，此時液體由青色變成透明，然後取出 Steel Wool，輕輕打發水分後迅速放置有蓋之平皿內，並放入玻璃乾燥器內，蓋之，瓶口以真空用油脂塗布，如能以真空幫浦再吸引出若干空氣後，再放進約 10% 之 CO2 者效果更佳。
4.6. 2. 黃燐培養法：
 
(1) 血液加 Liver veal agar plate 塗抹材料。
(2) 準備不鏽鋼厭氣性培養瓶或密閉之玻璃容器，其下面放水，放置比水面高之臺一個。
(3) 平皿培養器用紙包紮後放進裏面台上。
(4) 平皿內放砂，上面置碳酸鈣，再其上面放黃燐片，收存於瓶內水中之黃燐以鑷子小心取出後，吸其水分然後放在碳酸鈣上，黃燐量即容器內 1 公升時大約要 1g，但因危險無法一一秤量，可放多一點在培養基，終了時殘留之黃燐仍燃燒著較好。
(5) 燒紅之白金線觸及高燐後即開始燃燒。
(6) 迅速加蓋，密栓或以繩子綁好。
(7) 黃燐燃燒氧氣消失時，火煙變黃褐色。
(8) 輕輕放入恆溫器內。
(9) 48 小時後自恆溫器內取出，殘留之黃燐會燃燒，即刻與砂放在平皿浸入水中，黃燐即不再燒，因含有黃燐之砂有危險，需要棄於安全地帶。
   
4.7. 細菌培養法之應用
4.7. 1. 生菌數計算：
  　　常用為食品衛生之指標之一，如飲水、飲料、乳汁中之生菌數計算，方法如圖 4.7。
 
4.7. 2. 大腸菌之檢出與計算：
  　　大腸菌之檢出與計算，在公共衛生及流行病學上亦為一重要指標，因可表示有無糞便污染之情形及其污染程度，其檢查方法及計算方法如圖 4.8~4.10。
   

 
4.7. 3. 空中落下細菌數之測定：
  　　此方法常用於測定一些需要較嚴格衛生條件下的場所，如實驗室、種雞場孵化室等的清潔狀況的測定，其實施方法如圖 4.11。
 
4.7. 4. 沙門氏桿菌之檢出與計算：
  　　與大腸菌之檢出與計算一樣亦為公共衛生及流行病學上之重要指標，其方法如圖 4.12 及 4.13。