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豬水疱病

內容
目的
豬水疱病實驗室診斷標準操作程序（以下簡稱本標準）所制定之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行豬水疱病實驗室診斷標準操作時所必需之程序，以確保檢驗水準之一致。
 
名詞定義
1. 豬水疱病：
  豬水疱病（Swine Vesicular Disease；SVD）是豬的傳染性病毒性疾病，其特徵是皮膚出現水疱病變及繼發的口、鼻和蹄的上皮糜爛，本病被國際畜疫會 (OIE) 列為 A 表的動物傳染病。臨床上SVD與口蹄疫(Foot and Mouth Disease；FMD)、水疱性口炎(Vesicular Stomatitis；VS)及豬水疱疹(Vesicular Exanthema of Swine；VES) 難以區別。SVD在臨床上與FMD容易混淆，這是本病最重要之處，因此SVD病例要藉由實驗室檢測來與FMD區別。本病之潛伏期約為2至7天，並可能出現短暫型41 ℃的發熱現象，然後水疱出現在冠狀帶，典型是出現在蹄趾接合處，這些會影響整個冠狀帶而引起脫蹄。有些水疱會出現在鼻吻部，特別是鼻吻背部表面，水疱也可能長在乳頭、口腔、唇部及舌黏膜，亦可見到膝部淺處潰瘍現象，因而造成豬有出現跛行和幾天不食之現象。感染豬通常2至3週即可恢復，本病感染後唯一重要特徵是在蹄部出現一條深色水平線，這是起因於蹄部生長一時性受阻。而臨床症狀會因感染豬年齡、飼養狀況和病毒株不同而出現不同結果，若被毒力輕的病毒株感染，可能看不出異樣，但幼畜影響會較嚴重。感染豬自臨床症狀出現到48小時間會自鼻、嘴和糞便中排泄病毒，大部份病毒是感染後的7天內從口、鼻產生出來，直到2週後停止，但病毒在糞便中會持續排毒到三個月之久，並可持續存在破裂水疱壞死組織中。
   
  參考文獻：
  　Loxam J.R.＆Hedger R.S., (1983). Swine vesicular disease: clinical signs, diagnosis, epidemiology, and control. Rev .sci. tech. Off. int. Epiz., 2, 11-24.
   
2. 豬水疱病病毒：
  豬水疱病毒（Swine Vesicular Disease Virus；SVDV）係由小核糖核酸病毒科(picornaviridae)中，腸病毒屬 (Enterovirus) 之水疱病病毒所引起之豬隻高度傳染性疾病，在抗原上與人類病毒coxsackievirus B5 group有相關。本病毒為單鏈的RNA病毒，直徑為280 °A ，在150S的沈降速率下為球型顆粒。本病毒對環境有極大抵抗力，並在pH值範圍2.4至12.0中穩定存在。
 
設施及材料
(1) 實驗室：符合國家安全標準三級負壓隔離實驗室
(2) 高速離心機：Kubota 1920
(3) 恆溫箱：SHEL LAB model TC 2323
(4) 定軌搖擺器：Flow Laboratories
(5) 水浴槽：Hotech, water bath 810
(6) 顯微鏡：Zeiss, Germany
(7) 振盪器：VORTEX GENIE-2
(8) 自動控溫循環機：Perkin Elmer Cetus 9600
(9) 酸鹼值測定器 (pH Meter)：Basic Model 321
(10) ELISA 光度比色判讀機 (ELISA Reader)：Dynex
(11) 可調式供電器和電泳槽：(Gelman或同級品)
(12) SVD Ag ELISA kits：英國坡布萊( Pirbright；UK)口蹄疫世界參考實驗室供應。
(13) SVD-Ab kit ：荷蘭EVL公司出品
(14) 豬水病病毒株：1997年高雄分離株(經英國坡布萊口蹄疫世界參考實驗室確認)
(15) 乳缽和乳棒：台製
(16) 玻璃粉：台製
(17) 甘油：Merck
(18) 碳酸鈉：Merck
(19) 碳酸氫鈉：Merck
(20) ELISA 專用 96 孔盤：Nunc Immunoplate
(21) 六孔細胞培養盤：Nunc
(22) 酵素結合免疫吸附試驗相關設備：1-20 mL 微量分注器、8 爪或12 爪微量分注器、未被覆抗原抗體之96 孔微量免疫盤
(23) 酵素結合免疫吸附法相關試劑：Ortho-phenylenediamine (OPD)：Sigma3,3'5,5'-Tetramethyl Benzidine (TMB)：PIERCE雙氧水 (Merck)、硫酸液 (Merck)、脫脂奶粉 (Marvel)
(24) 核酸萃取相關試劑：Trizol reagent (GIBCO BRL)、ethanol (Merck)、chloroform (Sigma)、isopropanol alcohol (Merck)、diethyl pyrocarbonate (Sigma)
(25) PCR反應相關試劑：2'-Deoxynucleoside 5'-Triphosphate (Pharmacia)、DyNAzyme DNA Polymerase(FINNZYMES)、rRNasin (Promega)、AMV Reverse transcritase (Promega)、primer、Template DNA
(26) 50 X TAE 緩衝液：供洋菜膠片配製用。配方：0.04 M Tris base； 0.04 M acetic acid； 0.001 M EDTA pH 8.0。
(27) 標記 DNA (Marker DNA)：市售不同分子量的 DNA 標記溶液，為 100 bp Ladder 標記 DNA。(Gen Sura Lab. Inc.)
(28) 磷酸緩衝食鹽溶液：
NaCl (Merck) 8.0 gm
KCl (Merck) 0.2 gm
Na2HPO4.7H2O (Merck) 2.17 gm
KH2PO4 (Merck) 0.2 gm
加蒸餾水至   1,000 mL
以121 ℃ 15 lb/CM2高壓滅菌20分鐘。並以T.S.A. Agar 作無菌檢定。
(29) 細胞培養液：每包 1公升裝之 MEM 鹽基粉末 (Gibco) 加入滅菌再製蒸餾水至 1 公升。經溶解後加入 2.3 gm 之NaHCO3，以 0.22μm Millipore 過濾並分裝於 500 mL 血清瓶內，經TSA Agar無菌檢定通過後放入 4 ℃ 冰箱保存備用。
(30) 細胞生長液每 100 mL MEM 細胞培養液內加入8 mL 胎牛血清 (8 %) 及抗生素 (Penicillin 100 U/mL 和Streptomycin 100 μg/mL)，供細胞增殖培養用。
(31) 細胞維持液係於每 100 mL MEM 細胞培養液內加入 2 mL 胎牛血清 (2 %) 及抗生素 (同細胞生長液)，供細胞維持用。
 
豬水疱病病原的檢測
1. 豬水病實驗室診斷
(1) 樣品採集
  為了對水疱性口炎、口蹄疫及豬水疱病三種水疱性疾病做區別診斷，因此收集病材的方式必須相同。可自口唇病變處、蹄及其他任何有水疱形成部位取得，以水疱液、未破水疱上皮、新破水疱上皮為最佳樣品。病材採取以發病中豬隻的水疱液為最佳。以無菌注射針筒小心抽取，儘量採至 1 mL以上，置無菌試管內。如無法取得水疱液則採取病變部上皮病材，以未破或剛破不久之水疱上皮最好，至少要採集 1 公克量，水疱上皮需置於5 mL可密封之塑膠無菌瓶，並加入輸送液2 mL (如附錄一之一)，如無輸送液，可以不加胎牛血清之細胞培養液 (如附錄一之二) 或磷酸鹽緩衝 (phosphate buffer saline；PBS)代替(如附錄一之三)，最佳pH值需為7.2～7.6。病材須馬上冷藏於8 ℃以下，並於12小時內連同病歷表專人送達負壓隔離密閉診斷實驗室 (安全操作規範如附錄二) 進行確診。
  在恢復期的病畜身上很難採到可供確診的病材，此時可收集血清以檢測SVD特異性抗體。自同一動物體取得配對血清(pairs of sera)，兩次採樣間隔2星期，檢測兩次之間抗體變化情形可協助疫情之研判。
   
  參考文獻：
  　Kitching R.P.＆Donaldson A.I. (1987). Collection and transportation of specimens for vesicular virus investigation. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 6, 263-272
   
(2) 樣品製備
(a) 先將採集到之樣品登錄在登記簿上。
(b) 取新鮮水疱液，若無法取到水疱液則取病變部上皮製成懸浮上清液。
(c) 病變部上皮需先用研缽磨碎後 (可加入玻璃粉幫助研磨)，加上5-10 mL含1 ﹪小牛血清和抗生素之磷酸緩衝液作成10 ﹪乳劑。
(d) 乳劑經1,000 xg離心5分鐘後取出上清液分裝保存於4 ℃，供病毒分離或酵素結合免疫吸附試驗用，但不可超過二天，長期則保存於 -70 ℃。
   
(3) 病毒分離
  水疱性疾病中水疱性口炎病毒會在非洲綠猴腎細胞(African green monkey kidney cells；VERO)、幼倉鼠腎細胞 (Baby hamster kidney-21；BHK-21) 及豬腎細胞株 (IB-RS-2) 三種細胞出現細胞病變效應。口蹄疫病毒則會使BHK-21及IB-RS-2二種細胞出現細胞病變效應，而豬水疱病只在IB-RS-2及豬源細胞才會出現細胞病變效應。
(a) 以細胞生長液將IB-RS-2細胞或其它具感受性之豬源細胞培養在六孔細胞培養盤。
(b) 將新鮮水疱液或乳劑上清液取1-2 mL接種到已長成單層化之上述細胞。
(c) 將六孔細胞培養盤置於37 ℃恆溫箱中一小時以進行病毒吸附作用。
(d) 以PBS洗滌細胞後吸出清洗液。
(e) 加入MEM細胞維持液(含2 ﹪胎牛血清)，置入37 ℃ 5 % CO2 恆溫箱中培養。
(f) 接種後，每天以顯微鏡觀察其有無細胞病變作用（Cytopathic effect；CPE）產生，其特徵為細胞出現折射（refractility）、細胞圓形化（cell rounding）、細胞可延長及細胞質橋（星狀細胞）回縮等現象。亦可取出1 mL病毒液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒，當試管內細胞完全出現細胞病變作用時，收取上清液作酵素免疫吸附試驗（ELISA）以鑑定病毒。
(g) 經3天仍無CPE則需再繼代，並以第一代培養細胞經冷凍、解凍、離心後取上清液來繼續接種新的單層細胞，並重複 (b) 到 (f) 之步驟。
   
2. 酵素結合免疫吸附試驗（Enzyme-linked immuno-sorbent assay；ELISA）檢測SVD病毒抗原。
  試劑由英國坡布萊的口蹄疫世界參考實驗室 (Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, UK) 所研發的間接三明治式酵素結合免疫吸附試驗診斷試劑，目前由該實驗室所提供之診斷試劑套組可以檢測鑑定豬水疱病及口蹄疫O、A、C及Asia-1四種血清型（如附錄一之十二）。由於豬水疱病的臨床症狀及病變難以和口蹄疫做區分，故檢測時要與口蹄疫一起檢測。試驗步驟如下：
(1) 被覆試盤 (Coating of Microplates)：
(a) 將兔抗 FMDV Type O、A、C、Asia-1及SVDV抗血清，每瓶分別溶解於0.5 mL Reconstitution Diluent ﹟1溶劑 (含0.02 % merthiolate 的無菌去離子水)，保存於4 ℃下。
(b) 將兔子抗口蹄疫病毒各血清型及豬水疱病病毒之抗血清，以覆蓋用被覆液（coating buffer）（如附錄一之四），依說明書標示之稀釋倍數稀釋後加於96孔ELISA免疫盤 （EIA盤）中，每孔50 μL。(Type O：250 X； Type A、C、Asia-1 及SVDV：1000 X)
  註:96孔ELISA盤在恆溫箱中的定軌搖擺器上最好不要重疊放置，否則會因熱差度效應而造成試驗誤差。
(c) 以膠帶密封EIA盤後，置於定軌搖擺器 (orbital shaker) 上，以每分鐘120次的轉速搖擺震盪，於37 ℃作用1小時，或於4 ℃靜置一夜。
  註:被覆液 (稀釋1000倍)配置後保存於4℃下，以使用一週為限。
   
(2) 加入抗原對照與病材：
(a) 先倒掉EIA盤內的液體。以清洗液（如附錄一之五）用手動或自動清洗機注滿EIA盤上所有各孔。
(b) 倒掉清洗液，然後將EIA盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾。以此法反覆洗滌及拍乾五次，儘量將清洗液除去。
(c) 先加稀釋液A（如附錄一之六）至第5,6行，每孔50 μL 作為空白對照 (blank)。
(d) 以稀釋液B （如附錄一之七）配製陽性抗原對照 (FMDV Type O、A、C、Asia-1及SVDV)。強陽性 (Strong) 為1：10，弱陽性 (Weak) 為1：100。
(e) 加入50 μL 強陽性對照 (FMDV抗原O、A、C、Asia-1及SVDV抗原) 至1,2行，弱陽性對照加於3,4行。病材乳劑（檢體）亦加50 μL 至7,8行（檢體1）、9,10行（檢體2）及11,12行（檢體3）。配置圖如下：
 
(f) 蓋上盤蓋，置於定軌搖擺器上，以每分鐘120次的轉速搖擺震盪，於37 ℃作用1小時。
   
(3) 加入檢測抗體 (Detecting antibody)：
(a) 在前一步驟反應時間到達前，預先以稀釋液B配置五種天竺鼠檢測抗血清 (Blocked guinea pig detection sera)。五種天竺鼠抗FMDV O、A、C、Asia-1及SVD抗血清各以B稀釋液配製1：100倍稀釋。
(b) 倒掉EIA盤內的液體，以清洗液注滿盤上所有各孔，然後將EIA盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾。以此法反覆洗滌及拍乾五次，盡量將清洗液除去。
(c) 從A至E排各孔依次加入稀釋的天竺鼠抗FMDV O、A、C、Asia-1及SVD抗血清各50 μL。加完後，以手輕拍微量盤的側面以使各孔的內容物均勻混合。
(d) 蓋上盤蓋，置於定軌搖擺器上，以每分鐘120次的轉速搖擺震盪，於37 ℃作用1小時。
   
(4) 加入接合物 (conjugate)：
(a) 取出冷凍乾燥的兔抗天竺鼠接合物 (Rabbit anti-guinea pig Ig conjugated to horse radish peroxidase；HRPO) 溶解於0.5 mL Reconstitution Diluent ﹟2溶劑 [含 0.02 % merthiolate的無菌去離子水/甘油 (50 %，v/v)混合液] 中，保存於 4 ℃冰箱。
(b) 在前一步驟反應時間到達前，預先以B稀釋液（如附錄一之七）配製1：200倍的接合物稀釋溶液，以每盤6 mL之液體量來計算所需數量。
(c) 倒掉EIA盤內的液體，以清洗液注滿盤上所有各孔，然後將EIA盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾。以此法反覆洗滌拍乾五次，儘量將清洗液除去。
(d) 從A至E排各孔依次加入稀釋的酵素連結之兔抗天竺鼠血清，每孔50 μL。
(e) 蓋上盤蓋，置於定軌搖擺器上，以每分鐘120次的轉速搖擺震盪，於37 ℃作用1小時。
   
(5) 加入受質 (Substrate)
(a) 前一步驟的反應時間到達前，將受質（如附錄一之八）加入呈色劑（如附錄一之十）中，即取24 μL的H2O2加入6 mL之正-酚基二氨 (ortho-phenylene diamine；OPD) 溶液中。
(b) 倒掉EIA盤內的液體，以清洗液注滿盤上所有各孔，然後將EIA盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾。以此法反覆洗滌及拍乾五次，盡量將清洗液除去。
(c) 每孔加入50μL受質反應液，置於室溫下作用15分鐘。
   
(6) 判讀檢測結果：
(a) 受質經過15分鐘反應後，立即在各孔加入50μL反應停止液 (如附錄一之十一)。
(b) 將EIA盤置入ELISA判讀機以波長OD 492 nm檢測其吸光質（OD值），平均吸光值扣除背景值後大於0.1者為陽性，接近0.1者需再重測或以細胞培養觀察其有無細胞病變產生，有細胞病變者須再以酵素結合免疫吸附法確定之。
  註:判讀機於使用前需預先暖機至少15分鐘。
   
3. 反轉錄聚合酶鏈反應 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction；RT-PCR) 檢測病毒核酸
  應用反轉錄聚合酶鏈反應技術已設計出豬水疱病特異性引子，利用此引子可從水疱性疾病中鑑別豬水疱病。引子核酸序列如下:
  primer P7序列為5'-TGCAATCACACCTGGCAATGGT-3' (antisense)
primer P8序列為5'-TGACTGAAGGGTAGGACAGAT-3' (sense)
(1) RNA之萃取
(a) 取100 μL 水疱液或上皮病材懸浮上清液置於1.5 mL微量離心管中，加入1 mL TRIzol RNA 萃取劑劇烈震盪 (vortex) 30秒後靜置室溫5分鐘。
(b) 加入200 μL 氯仿 (chloroform) 以手壓住微量離心管頂蓋，劇烈震盪15秒後靜置室溫3分鐘，於4 ℃ 12,000 xg離心15分鐘。
(c) 小心吸取上清液 (約500 μL) 與等量異丙醇 (isopropyl alcohol) 混合完全後靜置室溫10分鐘，於4 ℃ 12,000 xg離心15分鐘。
(d) 去上清液，加入1 mL 75 ﹪乙醇 (alcohol) 經搖動後於4 ℃ 7,500 xg離心5分鐘後去上清液。
(e) 經短暫離心後，以10 μL滴管頭 (Tip) 將殘餘液體吸乾 (小心不要攪動RNA團塊)。靜置5至10分鐘風乾。
(f) 經乾燥之RNA團塊加入60 μL 經DEPC處理過之二次蒸餾（如附錄一之十三）溶解RNA，可立即使用或保存於 -70℃中備用。
   
(2) 反轉錄聚合酶鏈反應 (reverse-transcription polymerase chain reaction；RT - PCR)
  本試驗採一步反應 (one step reaction)，即反轉錄作用 (reverse transcription；RT)及聚合酶作用 (polymerase chain reaction；PCR) 在同一支反應管內進行，所需的試劑同時加在同一支反應管內，其特點為操作簡便，可節省時間及人力。
(a) 配製反應液：(每一支反應管包含以下反應試劑)
dNTP(1.25 mM) 16 μL
10X buffer (Prozyme buffer) 10 μL
r RNasin 0.4 μL
AMV (Reverse-transcriptase) 0.4 μL
Dynazyme (DNA polymerase；2U /μL) 1 μL
Primer (sense antisense mix 50 p mol/μL) 1 μL
RNA template 12 μL
DDW (RNase free) 59.2 μL
反應總體積為100 μL
(b) 反應條件：
  反應液混合均勻後隨即放入熱循環器中，先以42 ℃進行40分鐘反轉錄作用後直接進行聚合酶鏈反應，反應條件如下：
 
  註：每次反應皆須包括一個陰性對照及一個陽對照。
  陰性對照：不含病毒RNA，以12 μL 蒸餾水代替，其餘皆與試驗組相同。
  陽性對照：RNA template為SVD病毒純化之RNA溶液。
   
(3) 瓊脂膠電泳
(a) 取2公克瓊脂膠 (Agarose) 加入100 mL之1 X TAE電泳緩衝液配製成2 ﹪瓊脂膠溶液，以微波爐加熱溶解瓊脂膠直到呈現完全透明狀態。
(b) 置於55 ℃恆溫水槽中，待內外溫度平衡後加入50 ng/ml之溴化乙醯液 (ethidium bromide) 並混合均勻。
(c) 將膠液倒入製膠台中，插入電泳梳 (comb) ，待膠液冷卻凝固後拔出電泳梳。
(d) 將膠片裝入塑膠袋密封後放入不透光紙袋內，置入4 ℃冰箱中保存。
   
(4) 電泳分析
(a) PCR反應產物取出10 μL預先與2 μL之6倍載入緩衝液(loading buffer) 混合均勻後注入齒槽洞中，最後一孔加入5 μL之DNA梯形標誌。
(b) 將電極選定為"-"極到"+"極，以100伏特電壓泳動25分鐘。
(c) 電泳完畢後將膠片置於UV透視燈下觀察，陽性樣品及陽性對照組會出現一條長紋(band)為 216 bp之RT- PCR產物，陰性樣品及陰性對照則無產物出現。
註：引子序列取材自下列文獻：
  　W. Vangrysperre and K. De Clereq (1996) Rapid and sensitive polymerase chain reaction based detection and typing of foot-and-mouth disease virus in clinical samples and cell culture isolates, combined with a simultaneous differentiation with other genomically and/or symptomatically related viruses. Arch Virol 141:331-344
 
豬水疱病血清學的檢測
1. 酵素結合免疫吸附法（ELISA）檢測抗體
  本試驗所採用之ELISA法是由Brocchi等人所發展出來，其原理是先使用Mab5B7單源抗體將SVD抗原捕捉（capture）到基底盤，由測試血清對結合過氧化氫之單源抗體（Mab5B7）結合能力的抑制程度來作為評估指標，最後藉由加入受質來檢測含過氧化氫單源抗體的結合量。本試驗所採用之ELISA抗體檢測試劑係購自荷蘭B.V. European Veterinary Laboratory（EVL）所生產之Swine Vesicular Disease Virus Test kit（SVD-Ab kit）（如附錄一之十四）。試驗步驟如下：
(1) 將已被覆（coating）Mab5B7單源抗體的EIA盤從4 ℃冰箱中取出並放置於室溫中回溫。
(2) 待EIA盤回溫後撕開EIA盤之塑膠封膜。
(3)

EIA盤中除A1,B1,C1及D1以外之每孔加入40 μL之ELISA緩衝液，隨後加入10 μL 之待測血清到已加有緩衝液之微量孔中（但E1及F1除外），E1及F1則加入10 μL之緩衝液。A1及B1加入50 μL之陽性對照，另外C1及D1則加入50 μL陰性對照。
 
註：SVD-Ab kit抗體診斷盒屬於定性試驗，無法檢測抗體力價，僅能判定血清有無豬水疱病病毒抗體。
(4) 隨即加入50 μL結合HRPO之單源抗體（Mab5B7）到除E1及F1外之每孔中，E1及F1則加入50 μL之緩衝液。
(5) 蓋上盤蓋，並以膠帶封住盤蓋後，置於定軌搖擺器 (orbital shaker) 上，以每分鐘120次的轉速搖擺震盪，於室溫下作用120分鐘。
(6) 以手抓住EIA盤，甩掉盤內體液後加入250 μL清洗液後，重覆清洗四次。
(7) 倒掉清洗液，然後將EIA盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾，以盡量將清洗液除去。
(8) 每孔加入100 μL受質（TMB）後置於室溫下15至25分鐘。
(9) 每孔加入100 μL停止液以終止反應。
(10) 加入中止液後，隨即以ELISA reader採OD450判讀結果。
(11) 判定標準。加入停止液時，如果血清中不含豬水疱病病毒抗體則呈現黃色，表示血清抗體陰性。反之呈現無色或淺藍色，表示血清抗體陽性。
  參考文獻：
  　Brocchi E.,Zhang G., Gamba D.＆De Simone F. (1995). Development of two novel monoclonal antibody-based ELISAs for the detection of antibodies and the identification of swine isotypes against swine vesicular disease virus. J. Virol. Methods, 52, 155-167.
   
2. 病毒中和試驗
  SVD之病毒量化中和微量試驗是使用IB-RS-2細胞（或具感染性之合適豬源細胞）在組織培養平底微量盤中操作。生長在IB-RS-2單層細胞的病毒加入50 % 甘油後，可儲存在 -20 ℃ 冰箱中，SVD病毒在此情況下，至少可穩定存放1年。試驗前要將血清以56 ℃ 非動化30分鐘（若用於ELISA試驗之血清不可非動化，否則會提高非特異性反應），陽性對照標準血清是採復原期第21天的豬血清。本試驗是採體積50 μL之二倍稀釋法，其試驗步驟如下：
(1) 以10 mL塑膠注射筒 (不加抗凝劑) 由頸靜脈抽取5 mL的血液，裝於塑膠無菌試管連同病歷表送檢，血液只可冷藏不可冷凍。
(2) 血清以細胞培養液稀釋，從1/4倍稀釋起，待測血清沿稀釋盤以2倍序列連續稀釋，每一個血清做二重覆 (Duplicate)，每孔50 μL。
(3) 每孔加入50 μL含有100 TCID50 之SVD病毒懸浮液（病毒力價測定及病毒回歸力價之測定如附錄三及附錄四）。
(4) 對照組包括已知力價的標準抗血清、細胞對照及培養基對照和另一盤本試驗中用來計算實際病毒力價的病毒力價測試盤。
(5) 蓋上盤蓋後置於37 ℃ 感作1至1.5小時。
(6) 以10 % 胎牛血清的生長培養基，計算配置成每mL含3.5 × 105 個細胞，每孔加入50 μL細胞懸浮液。
(7) 培養盤用伸縮帶封住，培養於37 ℃ 2至3天。亦可蓋上適當蓋子，置於一大氣壓下含5 ±0.5 % CO2之培養箱中培養2至3天。
(8) 48小時後使用光學顯微鏡進行判讀。培養盤一般在第三天固定並染色，固定液是用10 % formolsaline作用30分鐘，再浸入含0.05 % 甲基藍之10 % formalin中染色30分鐘，培養盤並以自來水洗滌。
(9) 細胞層被染成藍色是為陽性，陰性則是孔內空白（細胞因CPE而死亡），血清抗體力價是以血清/病毒混合物中之血清50 % 最終稀釋濃度（50 % end point）表示，這是當每孔實際使用的病毒量介於101.5 到102.5 TCID50 時，且陽性標準血清在預期力價的2倍內才適用。
(10) 判讀結果：病毒中和力價大於或等於64倍者為陽性，介於16倍及32倍之間為疑陽性，小於或等於8倍者為陰性
  參考文獻：
  　Golding S.M., Hedger R.S., Talbot P.＆Watson J. (1976). Radial Immunodiffusion and serum neutralisation techniques for the assay of antibodies to swine vesicular disease. Res. Vet. Sci., 20, 142-147.
 
流程圖

 
1. 血清學試驗
  病材：配對血清(paired sera)
  方法：中和抗體力價測定
　酵素結合免疫吸附法檢測
   
2. 病毒分離
   
3. 病材：水疱液或水疱 上皮乳劑
  方法：接種於已形成單層細胞之IB-RS-2細胞或豬源細
   
4. 病毒確認
  酵素結合免疫吸附法或反轉錄聚合酶鏈反應
 
附錄一：各種試劑配製方法
1. 輸送液
  甘油一份、0.04 M PBS一份，加入500 IU/mL青黴素、500 mg / mL鏈黴素，以0.1 M NaOH（附錄一之六）調整pH值至pH 7.2～7.6。
   
2. 細胞培養液
  取1X MEM(GIBCO) 1000 mL，加入青黴素(100 IU / mL)、鏈黴素(100 mg / mL)及Fungizone (250 mg / mL)，標貼後保存於4 ℃，不可超過四週。
   
3. 0.08 M PBS
  取PBS粉末一瓶（Sigma），溶於滅菌過之蒸餾水125 mL中，調整pH值為7.4 ±0.20，標貼後保存於4 ℃，不可超過二週。
   
4. 被覆緩衝液（Coating Buffer）：0.05 M Carbonate / bicarbonate，pH 9.6 ±0.05
  取一膠囊Carbonate / bicarbonate溶於100 mL蒸餾水中 標貼後保存於4 ℃，不可超過一週。
   
5. 清洗液(0.002 M PBS)
  取PBS粉末一瓶（Sigma）溶於5000 mL滅菌過之蒸餾水中，調整pH值為7.4 ±0.2，標貼後保存於室溫，不可超過二週。
   
6. 稀釋液A（Diluent Buffer A）
  取PBS粉末一瓶（Sigma）溶於1000 mL滅菌過之蒸餾水中，加入0.5 mL之Tween 20 (pH 7.4)，標貼後保存於4℃，不可超過二週。
   
7. 稀釋液B（Diluent Buffer B）
  取100 mL稀釋液A，加入5公克Skimmed Milk粉末，標貼後保存於4 ℃，不可超過二週。
   
8. 受質（Substrate Stock）：3 ﹪(W/V) H2O2 （882 mM）取一錠過氧化氫溶於10 mL蒸餾水中，標貼後保存於4 ℃黑暗處。
   
9. Chromogen Buffer：0.05 M phosphate-citrate buffer, pH 5.0取phosphate-citrate buffer一錠（Sigma），溶於100 mL蒸餾水中，調整pH值為pH 5.0，標貼後保存於4 ℃，不可超過一週。
   
10. 呈色劑（Chromogen Stock）：3.3 mM OPD取Ortho-Phenylenediamine（OPD）一錠（Sigma），溶於50 mL Chromogen Buffer pH5.0（如附錄一之九）中，標貼後保存於室溫黑暗處。
   
11. 停止液（1.25 M Sulphuric Acid）
  慢慢的將68 mL濃鹽酸(18 M)，加入932 mL之蒸餾水中，標貼後保存於室溫
   
12. FMD酵素結合免疫吸附試驗診斷盒抗原檢測試劑內容包含如下：
(1) 兔抗 FMDV Type O、A、C、Asia-1 及SVDV 抗血清。
(2) 天竺鼠抗 FMDV Type O、A、C、Asia-1 及SVDV抗血清。
(3) FMDV Type O、A、C、Asia-1 及SVDV抗原對照。
(4) 兔抗天竺鼠結合horse-radish peroxidase (HRPO) 結合體。
(5) Carbonate/bicarbonate buffer capsules
(6) Phosphate Buffered Saline (PBS)
(7) Skimmed milk powder
(8) Tween 20
(9) Ortho-phenylenediamine
(10) Phosphate/citrate buffer tablets
(11) Sterile water (Reconstitution Diluent ﹟1)
(12) Sterile water/glycerol (Reconstitution Diluent ﹟2)
(13) Phenol Red
(14) pH indicater strips
(15) NUNC Immunoplate
(16) Maxisorp ELISA plate
   
13. DEPC處理水
  取1000 mL二次蒸餾水加入1 mL diethyl pyrocarbonate （DEPC）後劇烈搖動瓶子，使DEPC均勻分散在水中，再將瓶子置於黑暗處二天，讓DEPC將水中之RNase不活化，最後將處理好的水以121 ℃ 高溫高壓滅菌30分鐘，待冷卻後置於4 ℃保存備用。
   
14. SVD抗體檢測試劑盒（SVD-ab kit）內容包含下列八項：
  5 × 96孔微量盤，每孔皆被覆（coating）抗SVD病毒之單源抗體（Mab5B7）。
4 × 8 mL接合HRPO之SVD病毒單源抗體。
1 × 100 mL之100倍濃縮清洗液（使用時需以去離子水稀釋成一倍濃度使用）。
1 × 50 mL ELISA緩衝液
1 × 60 mL受質混合物
1 × 800 mL 陽性對照（冷凍乾燥）
1 × 800 mL陰性對照（冷凍乾燥）
1 ×100 mL停止液
  註：SVD抗體檢測試劑盒儲必須存於2-8 ℃ 冰箱中，並於有效期限內使用。
 
附錄二：隔離陰壓實驗室操作之安全規範：
1. 進入隔離陰壓實驗室時需先行於外更衣室脫光全身衣物並將衣物放置衣櫃內或掛鉤上。取下裝飾品例如戒指、首飾、手鐲、手錶以及眼鏡，放在外更衣室。然後赤裸地經由通道進入內更衣室。在內更衣室先穿上紙內褲再穿戴實驗衣褲、鞋帽後即可進入實驗室內進行實驗。隔離陰壓實驗室內最好另行放置一付眼鏡，否則離開隔離實驗室前需將眼鏡浸泡於消毒液內再以清水洗淨後戴出。
   
2. 離開隔離陰壓實驗室時需先行進入內更衣室脫去全身實驗衣褲、鞋帽。還要穿的實驗衣褲、鞋帽整齊放置在內更衣室衣櫥或掛鉤上，髒實驗衣褲、鞋帽則放進洗衣桶內以便消毒清洗。
   
3. 眼鏡若要戴出應浸泡於消毒液內 (最好能另配一付眼鏡專供陰壓實驗室內使用) ，進入淋浴棚內淋浴時，即可從消毒液內取出，以便淋浴時沖洗。在淋浴棚內首先咳痰及擤鼻涕，其目的是要把把進入呼吸道及喉嚨的病毒顆粒排出，再使用消毒藥皂和洗髮精，塗滿全身肌膚和頭髮再進行徹底洗淨。頭上和身上肥皂水，應沖洗乾淨後才可進入外更衣室。取架子上浴巾擦乾身體和頭髮，用過之浴巾應放入外更衣室洗衣桶內。然後穿上自己衣著後由外更衣室門戶離開隔離陰壓實驗室。
   
4. 陰壓實驗室內採用安全吸管裝置，禁止以口吸吸管。
   
5. 病材乳劑之製作、細胞接種及抗體檢測需在陰壓之生物級安全操作箱內進行。剩餘病材及使用過器材需放入不銹鋼盆或桶內，蓋上蓋子再移出陰壓生物級安全操作箱並作高壓蒸汽消毒。
   
6. 操作完畢後以適當消毒劑噴灑操作箱之操作台，並開啟紫外線燈。
   
7. 操作過程中所使用之試管、離心管均需為螺旋蓋型，避免病毒液外漏。
   
8. 實驗室器械及廢棄物之處理
(1) 剩餘病材：可暫時密封冷凍保存於 -70 ℃專用冰櫃待實驗流程圓滿完成後，取出經 120 ℃，20 分鐘之高壓蒸汽消毒後焚燬。
(2) 可重覆使用之器械如刀剪、鑷子等收集於密閉容器內經高壓蒸汽處理後清洗。
(3) 丟棄式之隔離實驗室衣帽和手套，收集於密閉袋內經高壓蒸汽處理後方可丟棄或焚燬。
 
附錄三：豬水疱病病毒株力價之測定






 
附錄四：豬水疱病病毒回歸力價之測定
1. 豬水病抗體中和試驗回歸力價測定：
a. 先製備0.5、1、2、4、20 TCID50的病毒液，從 -80 ℃超低溫冷凍櫃中取出SVD病毒株 (力價為107.0 TCID50 / 50 μL) ，待融解均勻後以含8 % 胎牛血清的培養液稀釋成100,000倍 (即稀釋病毒液virus working dilution )。稀釋後是否為100 TCID50，另以病毒的回歸力價測定 (通常30-300 log10 TCID50為接受的範圍值)。
b. 取0.4 mL的100 TCID50稀釋病毒液加到1.6 mL的細胞培養液稀釋成20 TCID50 ，於試管振盪器上充分混勻，再取0.4 mL的20 TCID50病毒液加入1.6 mL細胞培養液即成4 TCID50 ，經充分混勻後，再取1 mL的4 TCID50病毒液加入含1 mL細胞培養液即成2 TCID50，再依相同步驟連續稀釋二次完成1及0.5 TCID50的病毒液。
c. 從各濃度之稀釋病毒液 (100、20、4、2、1、0.5 TCID50) 中取50 μL加入含50 μL細胞培養液的病毒回歸力價對照盤，每濃度之稀釋病毒液分別以8孔加入為限。並同時與血清試驗樣品及陽、陰性對照組，置入37 ℃ 5 % CO2培養箱進行感作1~1.5小時，再加入100 μL之IB-RS-2細胞懸浮液最後繼續置入37 ℃ 5 % CO2培養箱培養48小時。即計算8孔中有幾孔產生細胞病變現象 (CPE)，作為計算病毒回歸力價的測定依據。
   
2. 豬水疱病病毒回歸力價之測定
 
   
3. Reed-Muench Methodz之計算TCID50方法
 
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