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水疱性口炎

內容
目的
水疱性口炎病毒分離及鑑定標準操作程序（以下簡稱本標準）所制訂之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行水性口炎病毒分離及鑑定操作時所必須之程序，並確保實驗室及操作人員之安全。
 
名詞定義
水疱性口炎病毒：
水疱性口炎(Vesicular stomatitis；VS)是馬、牛、豬的水疱性疾病，屬於棒狀病毒科(Rhabdoviridae)的水疱病毒屬(Vesiculovirus)。臨床上水疱性口炎與口蹄疫(Foot-and-mouth disease；FMD)及豬水疱病(Swine vesicular disease；SVD)難以區別。對水疱性口炎病毒具有感受性的動物包括馬、豬及牛，而口蹄疫可感染反芻獸及豬，豬水病只能感染豬，由於三種疾病的臨床症狀相似，因此確實且立即的區別診斷相當重要。水疱性口炎主要是直接經由皮膚或黏膜而感染，亦可自沙蠅(sandfly)及蚊子體內分離出來，因此推測水疱性口炎可經由昆蟲傳播，而季節的變換會影響本病之發生率。水性口炎常於熱帶地區雨季結束時或溫暖地區第一次降霜時節發生。此病的致病機序目前仍不清楚，且特異性的抗體亦無法預防水疱性口炎病毒之感染。水疱性口炎病毒在免疫學上主要分為兩型，棒狀病毒科(New Jersey；NJ)及印第安納型(Indiana；IND)，新澤西型以引起牲畜疾病為主，造成較嚴重的臨床症狀，潛伏期比印第安納型短。過去數十年來，許多其他相近的棒狀病毒已相繼自病畜身上分離出來，其中Salto-Argentina/63株及Alagoas-Brazil/64株最具代表性，分別被歸為印第安納型的IND-2及IND-3亞型。
 
設施及材料
(1) 實驗室：符合國家安全標準三級負壓實驗室
(2) 離心機：Hermle ZK364 , Jouan C412
(3) 桌上小型離心機：KM-15200，Kubota
(4) 顯微鏡：Zeiss，Germany
(5) 恆溫箱：Napco
(6) 水浴槽：Hotech，water bath 810
(7) 酸鹼值測定器(pH meter)：JENCO6091
(8) ELISA判讀機：Dynatech，USA
(9) 多管分注器：25~200μL，CAPP，Denmark
(10) 磷酸緩衝食鹽溶液(Phosphate-buffered saline；PBS)：
NaCl (Merck) 8.0 gm
KCl (Merck) 0.2 gm
Na2HPO4.7H2O (Merck) 2.172 gm
KH2PO4 (Merck) 0.2 gm
加蒸餾水至1,000mL 以121 ℃ 15 lb/CM2高溫高壓滅菌20分鐘。並以 Tryptic soy agar(TSA 作無菌檢定。
(11) 細胞培養液：
每包1 L裝MEM鹽基粉末(Gibco)加入滅菌再製蒸餾水至1 L。經溶解後加入2.3gm的NaHCO3，以0.22μ濾器(Filter，Millipore)過濾並分裝於500mL血清瓶內，TSA無菌檢定通過後放入4℃冰箱保存備用。
(12) 細胞生長液：
每100mL MEM細胞培養液內加入10mL胎牛血清(10%)及青黴素、鏈黴素兩種抗生素(Penicillin 100U/mL和Streptomycin 100μg/mL)，供細胞增殖培養用。
(13) 細胞維持液：
每 100 mL MEM細胞培養液內加入2mL胎牛血清(2%)及青黴素、鏈黴素兩種抗生素(含量同細胞生長液)，供細胞維持用。
 
水疱性口炎病毒分離及鑑定
1. 初代分離培養樣品採集與處理
  為了對水疱性口炎、口蹄疫及豬水疱病三種水疱性疾病做區別診斷，因此收集病材的方式必須相同。水疱液、未破水疱上皮、新破水疱上皮為最佳樣品，可自口唇病變、蹄及其他任何有水疱形成部位取得。但為顧及取材人員安全及動物權益，取病材時需先以藥物鎮靜動物。
  採得的上皮病材可放在裝有pH 7.2~7.6甘油緩衝液的瓶子內，上皮與甘油緩衝液體積比例不可超過1：10，保存於4℃或-20℃。若一時找不到甘油緩衝液，上皮病材可先冷凍起來，再裝進有乾冰的密封瓶內，避免二氧化碳進入瓶內使pH值降低破壞病毒。
  若無法自牛身上取得上皮組織，可用咽喉探杯(Probang cup)取得食道咽頭液(Oesophageal-pharyngeal fluid；OP fluid)；對豬取材時，可用棉棒擦拭咽喉(Throat swab)，送交實驗室分離病毒。一旦病材送到後，應放入不含血清的細胞培養液中，而食道咽喉液需在乾冰保存狀態下運送至實驗室。
  在恢復期的病畜身上很難採到可供確診的病材，此時可收集血清以檢測特異性抗體。自同一動物體取得成對血清(Paired sera)，兩次採樣間隔2星期，檢測兩次之間抗體變化情形以協助疫情之研判。
   
2. 病毒分離：
  病材可接種於特定細胞中，用轉動瓶 (Roller bottles) 培養比用角瓶培養敏感。可用的細胞有非洲綠猴腎細胞(African green monkey kidney cells；VERO)、幼倉鼠腎細胞(Baby hamster kidney-21；BHK-21)及IB-RS-2細胞。水疱性口炎病毒在三種細胞皆會出現細胞病變效應；口蹄疫病毒使BHK-21及IB-RS-2出現細胞病變效應；而豬水疱病只在IB-RS-2形成細胞病變效應。許多其他細胞株及來自動物的初代細胞，皆對水疱性口炎病毒具感受性。
  8至10日齡雞胚以尿囊腔接種、2至7日齡哺乳小鼠以任何途徑接種、3週齡小鼠腦內接種，皆能使水疱性口炎病毒增殖分離出來，被接種動物皆會在2至5日內死亡。皮內接種是對馬及牛最敏感的方式，豬則是對蹄冠狀帶及鼻部接種最敏感，在接種後2至4天，就能在口唇上皮、乳頭及蹄出現水疱。水疱出現的速度視病毒株毒力而定。出現細胞病變效應的組織培養上清液、死亡小鼠或雞胚肌肉骨骼組織的均質上清液及上皮病材上清液，皆可用於免疫學試驗以確認病原；其中小鼠腦組織為病毒最佳來源。形態學方面，水疱性口炎病毒、口蹄疫病毒及豬水疱病病毒具不同形態特徵，當水液或上皮組織含大量病毒時，可用電子顯微鏡做診斷，確認所屬科別。
   
3. 以酵素結合免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)檢測病毒抗原
  本方法係利用英國動物衛生研究所(Institute for Animal Health，Pirbright，UK)所研發的間接三明治式酵素結合免疫吸附試驗診斷試劑(Indirect sandwich ELISA)，區別水疱性口炎及其他水疱性疾病，並鑑定病毒亞型。步驟中需用一組以四種亞型病毒株(IND-1、IND-2、IND-3、NJ)製造出來的兔抗血清(Rabbit antisera)，故可檢測水疱性口炎病毒的四種亞型。試驗步驟如下：
(1) 被覆(Coating of microplates)：
(a) 將四種亞型的冷凍乾燥兔抗血清，每瓶分別溶解於0.5mL無菌去離子水中，保存於4℃下。
(b) 被覆前取適當量溶解的兔抗血清，以被覆液（Coating buffer，0.05M carbonate/bicarbonate，pH9.6，配置後保存於4℃下最多一週）稀釋1000倍。
(c) 在微量盤的第A至H排，依次加入稀釋的IND-1、IND-2、IND-3、NJ、IND-1、IND-2、IND-3、NJ兔抗血清。每孔分別加入50μL。
(d) 蓋上蓋子，置於規則搖擺器(Orbital shaker)上，以每分鐘100至120次的轉速震盪，37℃作用1小時。亦可在加入稀釋的兔抗血清後，於4℃下靜置一夜。
   
(2) 加入病材與對照組抗原：
(a) 先倒掉微量盤內的液體。將清洗液(Wash buffer：0.002M PBS)用自動或手動清洗機注滿微量盤所有的孔。倒掉清洗液，然後將微量盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾。以此法反覆洗滌三次。
(b) 病材(如雞胚胎的肌肉骨骼組織和小鼠組織)需以PBS製成10％懸浮液(將病材放在研缽中，以1:9與PBS混合研磨)，而組織培養上清液不必稀釋，只需離心去除細胞碎片即可。
(c) 在第1至6列的各孔中各加入50μL之A稀釋液(Diluent buffer A：含0.05%(v/v) Tween 20的0.01M PBS，pH7.4)。
(d) 在A1、E1孔加入12.5μL對照抗原IND-1，B1、F1孔加入12.5μL對照抗原IND-2，C1、G1孔加入12.5μL對照抗原IND-3，D1、H1孔加入12.5μL對照抗原NJ。(由於對照抗原內含有甘油，較為黏稠，吸取時必須小心，以確保吸取的體積正確。未用完的抗原，繼續保存於-20℃。)
(e) 利用多管分注器反覆吸沖三次，將第1列各孔內的液體充分混合。吸取12.5μL加入第2列對應的各孔。如此反覆操作，向右側稀釋至第4列，使第1至4列成為五倍連續稀釋。稀釋倍數由第1至4列依次為1/5、1/25、1/125、1/625倍。
(f) 將第1個待測病材各50μL加入第7、8列的A至D孔，第2個病材加入第7、8列的E至H孔，依此類推。加完後，以手輕拍微量盤的側面，以使各孔的內容物均勻混合。
(g) 蓋上蓋子，置於規則搖擺器上，以每分鐘100至120次的轉速震盪，37℃作用1小時。
   
(3) 加入檢測抗體(Detecting antibody)：
(a) 在前一步驟的反應時間到達前，預先以B稀釋液(Dliuent buffer B：含0.05% Tween 20與5%(w/v) 脫脂奶粉之0.01M PBS，pH7.4)配置四種天竺鼠檢測血清(Blocked guinea pig detection sera)。四種天竺鼠血清IND-1、IND-2、IND-3、NJ各以B稀釋液稀釋100倍。
(b) 先倒掉微量盤內的液體。將清洗液(Wash buffer：0.002M PBS)用自動或手動清洗機注滿微量盤所有的孔。倒掉清洗液，然後將微量盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾。以此法反覆洗滌三次。
(c) 將第A排至第H排各孔依次加入稀釋的IND-1、IND-2、IND-3、NJ、IND-1、IND-2、IND-3、NJ天竺鼠血清。加完後，以手輕拍微量盤的側面以使各孔的內容物均勻混合。
(d) 蓋上蓋子，置於規則搖擺器(Orbital shaker)上，以每分鐘100至120次的轉速震盪，37℃作用1小時。
   
(4) 加入接合物(conjugate)：
(a) 將每瓶冷凍乾燥的接合物(Rabbit anti-guinea pig Ig conjugated to horse radish peroxidase)溶解於1 mL溶劑(含0.02% merthiolate的無菌去離子水/甘油(50%，v/v)混合液)中，保存於-20℃下。
(b) 在前一步驟的反應時間到達前，預先以B稀釋液(Diluent buffer B：含0.05% Tween 20與5%(w/v) 脫脂奶粉之0.01M PBS，pH7.4)配置1/200稀釋的接合物溶液。
(c) 先倒掉微量盤內的液體。將清洗液(Wash buffer：0.002M PBS)用自動或手動清洗機注滿微量盤所有的孔。倒掉清洗液，然後將微量盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾。以此法反覆洗滌三次。
(d) 將稀釋的接合物溶液由第A排至第H排依序加入各孔內，每孔50μL。加完後，以手輕拍微量盤的側面以使各孔的內容物均勻混合。
(e) 蓋上蓋子，置於規則搖擺器(Orbital shaker)上，以每分鐘100至120次的轉速震盪，37℃作用45分鐘。
   
(5) 加入受質(Substrate)：
(a) 預先將一錠OPD (Ortho-phenylenediamine)溶解於50 mL 磷酸/檸檬酸緩衝液(0.05M Phosphate-citrate buffer，pH5.0)中，使成為OPD原液。置於室溫下避光保存。
(b) 配置受質反應溶液：將30μL過氧化氫（3% (w/v) hydrogen peroxide，置於4℃下避光保存。）溶解於6 mL OPD原液中，可供微量盤一盤使用。所得的反應溶液含3.3 mM OPD與4.4 mM過氧化氫。配置完成的溶液應呈無色，避光保存。若有顏色應棄置重配。
(c) 到達前一步驟的反應時間時，先倒掉微量盤內的液體。將清洗液(Wash buffer：0.002M PBS)用自動或手動清洗機注滿微量盤所有的孔。倒掉清洗液，然後將微量盤倒置於毛巾或吸水紙上拍乾。以此法反覆洗滌三次。
(d) 在各孔內加入50μL受質反應溶液，置於室溫下作用15分鐘。
   
(6) 終止反應與讀取吸光值：
(a) 判讀機於使用前需預先暖機至少15分鐘。
(b) 受質經過15分鐘反應後，立即在各孔加入50μL反應終止液(Stop solution：1.25 M硫酸)。加完後，以手輕拍微量盤的側面以使各孔的內容物均勻混合。
(c) 確定各孔液面均無泡沫，並用吸水紙擦拭微量盤底部後，以判讀機讀取各孔在波長492 nm的吸光值。
   
(7) 判讀檢測結果：
(a) 首先檢視第1至4列五倍連續稀釋對照組的呈色反應，以確定抗血清良好被覆在微量盤上。
(b) 計算第A至H各排第5與第6孔的平均吸光值(兩孔吸光值相加除以二)，以作為背景值。將各血清型的吸光值扣除各血清型的背景值，所得即為實際的吸光值。
(c) 若校正後的平均吸光值大於背景值0.1以上，則判定為陽性。若接近0.1，可將該檢體重新檢測，或利用組織培養繼代以增殖病原。IND-1與IND-2兩種亞型之間有相當程度的交叉反應。IND-1抗血清與IND-3抗原間的反應性較低，IND-2抗血清與IND-3抗原間的反應較佳。IND-3抗血清與IND-1、IND-2兩種抗原間的反應性較低。
 
血清學試驗
確認及定量血清特異性抗體，可使用液相阻斷ELISA(Liquid-phase blocking ELISA；IP-ELISA)及病毒中和試驗(VN test)，而CF試驗可用於早期抗體之定量。
1. 液相阻斷ELISA(IP-ELISA)：
  可用於檢測水疱性口炎及定量病毒引起的抗體。推薦以病毒醣蛋白為抗原，其優點為不具傳染性，可檢測中和抗體量，同時偽陽性結果也較病毒中和試驗少。步驟如下：
(1) 固相：見前述間接三明治式酵素結合免疫吸附試驗。
   
(2) 液相：
(a) 使用平底微量盤，第一排血清稀釋為1/4倍，之後以2倍連續稀釋法依序稀釋。
(b) 每孔加入等體積水疱性口炎病毒NJ或IND型醣蛋白。
(c) 37℃作用1小時，吸取50μL混合液至ELISA固相盤，37℃搖擺作用30分鐘。
   
(3) 檢測劑、結合劑及受質：與間接三明治式酵素結合免疫吸附試驗所用試劑及方法相同。
   
(4) 結果判讀：根據Sepearmann-Karber法判定50％ end point力價，以陰性血清50％ reduction的log10值為參考值，力價高於1.3(1/20)者認為是陽性。
   
2. 競爭性ELISA：
  現已開發競爭性ELISA以檢測抗體，方法如Afshar et al.所述，利用Katz et al.提出之水性口炎NJ及IND-1型重組抗原為抗原。試驗步驟如下：
(1) 固相：
(a) 抗原以Carbonate/bicarbonate緩衝液(pH9.6)稀釋，取50μL加入96孔微量盤中。
(b) 4℃作用一整晚，已覆抗原的微量盤可保存於-70℃達30天。
(c) 使用時先解凍，倒掉抗原液，加入100μL阻斷劑。25℃作用30分鐘。
(d) 倒掉阻斷劑，以含0.05％ Tween 20的PBS洗三次。
   
(2) 液相：血清以含1％脫脂奶粉之PBS稀釋8倍，取50μL加入孔中。每個血清樣品做二重覆。37℃作用30分鐘後，每孔再加入50μL多價腹水液，於37℃作用30分鐘。
   
(3) 檢測劑：
(a) 微量盤以清洗液連續洗三次後，取50μL goat anti-mouse horse radish peroxidase conjugate(以含1％脫脂奶粉的PBS稀釋之)加入各孔中，於37℃作用30分鐘。
(b) 微量盤以清洗液連續清洗三次後，每孔加入50μL的Tetra-methyl-benzidine (TMB)溶液。25℃作用20分鐘。
(c) 每孔加入50μL 硫酸(0.05M)，以450nm波長判讀結果。
   
(4) 結果判讀：當樣品吸光值低於對照組50％時，判定為陽性。
   
3. 病毒中和試驗(Virus neutralization test)：
  血清樣品需先以56℃水浴非動化30分鐘，水疱性口炎NJ或IND型病毒量為100 TCID50 (50％ tissue culture infective dose)。使用的細胞為已形成單層的培養細胞或懸浮培養的IB-RS-2細胞，以細胞病變效應(Cytopathic effect；CPE)檢測未被中和之病毒。試驗步驟如下：
(1) 病毒：
  水疱性口炎NJ或IND型病毒。在IB-RS-2細胞增殖後，加入50％甘油，保存於液態氮或-20℃中。
   
(2) 樣品：
  血清在56℃非動化30分鐘，陽性及陰性標準血清亦需非動化。
   
(3) 病毒中和：
(a) 血清於第H排稀釋1/4倍，之後由第H排向第A排的方向做二倍連續稀釋，每個血清樣品做二列。(例如：預先在各孔加入50μL細胞培養液，然後將已稀釋2倍的血清50μL加入第H排。利用多管分注器反覆吸沖三次，將第H排內的液體充分混合。吸取50μL加入第G排。如此反覆操作，向上稀釋至第A列，使第H至A排成為二倍連續稀釋。)
(b) 每孔加入50μL內含100 TCID50病毒量的水疱性口炎病毒液。
(c) 在37℃作用60分鐘使中和反應完全。
(d) 取50μL混合液加入微量組織培養盤中。
(e) 每孔加入150μL含3×105個細胞的細胞液。
   
(4) 蓋上蓋子於37℃二氧化碳培養箱作用48小時，或以正壓膠帶封盤放在一般培養箱中作用。
   
(5) 結果判讀：當孔中細胞未形成細胞病變效應時，表示血清具保護力。依據Sepearmann-Karber法判定終點力價，當100 TCID50病毒液結果介於30~300 TCID50之間，且陽性及陰性標準血清與前次檢測值誤差在2倍以內者，當血清50％中和力價以log10表示時，若數值大於1.6(1/40)視為水疱性口炎病毒陽性。
 
附錄：水疱性口炎病毒株力價之測定

 

 


 
水性口炎抗體中和試驗回歸力價測定：
1. 先製備0.5、1、2、4、20 TCID50的病毒液。從-80℃超低溫冷凍櫃中取出水性口炎病毒株 (力價為107.0 TCID50 / 50μL ) ，待融解均勻後以含8 % 胎牛血清的培養液稀釋成100,000倍 (即稀釋病毒液virus working dilution )。是否為100 TCID50，另以病毒的回歸力價測定 (通常30~300 TCID50為接受的範圍值)。
2. 取0.4 mL的100 TCID50稀釋病毒液加到1.6 mL的細胞培養液稀釋成20 TCID50 ，於試管振盪器上充分混勻，再取0.4 mL的20 TCID50病毒液加入1.6 mL細胞培養液即成4 TCID50 ，經充分混勻後，再取1 mL的4 TCID50病毒液加入含1 mL細胞培養液即成2 TCID50，再依相同步驟連續稀釋二次完成1及0.5 TCID50的病毒液。
3. 從各濃度之稀釋病毒液(100、20、4、2、1、0.5 TCID50)中取50μL加入含50μL細胞培養液的病毒回歸力價對照盤，每濃度之稀釋病毒液分別以8孔加入為限。並同時與血清試驗樣品及陽、陰性對照組，置入37℃、5% CO2培養箱進行感作1~1.5小時，再加入100μL 之IB-RS-2細胞懸浮液最後繼續置入37℃、5% CO2培養箱培養48小時。即計算8孔中有幾孔產生細胞病變效應，作為計算病毒回歸力價的測定依據。

 

 
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