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雞黴漿菌症

內容
目的
雞黴漿菌症實驗室診斷標準操作程序（以下簡稱本標準）所制定之內容係提供實驗室處理相關病材、操作病毒之各種生物活性及診斷鑑定時所必須之程序，以確保實驗室操作人員之安全性，及維持對本病診斷鑑定之精確性與快速性。
 
名詞定義
1. 家禽黴漿菌症病原學的診斷：
引起家禽之呼吸器性症狀的疾病相當複雜，惟有就患禽進行病原的分離方為正確診斷的方法；雞黴漿菌M.gallisepticum較一般細菌特殊，也因此其分離上較為困難，非一般之培養基所能培養，必須在含有血清的特殊人工培養基上方得增殖發育，本標準引導試者如何取材及培養基之配製，進而培養方法以達成病原體之分離。
2. 雞黴漿菌症血清學的診斷：
家禽經黴漿菌感染後，於其血清中即產生對該菌種之特異性抗體，故可藉黴漿菌製成的抗原以不同之血清學反應試驗（如凝集，血球凝集抑制等），對雞隻罹患本症之診測。
 
設施及材料
1. 恒溫振盪水槽
2. 恒溫CO2培養器
3. 組織磨碎機
4. 高壓蒸氣消毒器
5. 顯微鏡
6. 陰陽壓真空幫浦
7. 高速遠心機
8. 超低溫冰櫃(-70~-100℃)
9. 普通水箱
10. 細菌過濾器(0.2,0.45μ)
11. 凝集玻璃片
12. 96孔U字型微量塑膠凝集盤
13. 黴漿菌液體培養基
14. 吸管(1.2.5.10.20ml)
15. 小試管
16. M.gallisepticum菌種
17. 受測雞全血
18. Sodium azide
19. 結晶紫
20. Bacto PPLO broth (w/o CV Difco)
21. Alsever液
22. 馬血清
23. Thallium acetate
24. 磷酸緩衝食鹽液
25. 中型滅菌塑膠培養皿
26. 小手術刀
27. 奇異筆
28. 滅菌綿花棒
29. 解剖器材（含解剖刀、小剪刀、鉗子、止血鉗．．）
30. 新鮮酵母抽出液
31. Penicillin G
32. 病材(檢體)
33. phenol red
34. Agar
35. Triphenyltetrazolium chloride
36. 硫酸銨
37. L.arginine
38. 葡萄糖
39. M.gallisepticum標準血清
40. Freund adjuvant ( complete & incomplete )
41. 家兔
42. 牛心肌浸出物
43. 獸肉蛋白
44. 雞肉、心、肝抽出物
 
病原的分離與同定
1. 培養材料的採取及保存：
為分離M.gallisepticum，其主要取材部住係由雞隻之氣管眼下洞、氣囊、肺等處取之。
(1) 氣管粘液之採取：患禽經解剖後以無菌小剪刀將氣管縱的剪開，再以無菌棉花棒，拭擦氣管內的粘液，置入含有培養液(1 ~ 0.5 ml)試管內，冷凍保存於-70℃超低溫冰櫃內備用。
(2) 眼窩下洞粘液之採取：以碘酒拭擦患禽的眼下部皮膚，再以小剪刀切開，將薄膜切除露出眼下洞，再以無菌棉花棒拭取粘液，置入含有培養液(1 ~ 0.5 ml)試管內，冷凍保存於-70℃超低溫冰櫃內備用。
(3) 氣囊及肺之採取：患禽經解剖後以無菌方式操作，採取前後之氣囊及肺之病變部，置入含有培養液(1 ~ 0.5 ml)試管內，冷凍保存於-70℃超低溫冰櫃內備用。
   
2. 培養基配製及培養
(1) 培養基之配製：應用國安氏之Barber的變法或Hofstad氏之培養基，其處方如下
A、Barber的變法培養基
  牛心肌浸出物（榮研） 100 g
  獸肉蛋白（榮研） 50 g
  NaCl 5 g
  葡萄糖 1 g
  Thallium acetate 0.25 g
  蒸餾水 1000 ml
pH7.8±0.1修正後，高壓滅菌，後置於4~10℃保存，使用時，取上述液體80ml加入20ml馬血清，1% phenol red 0.2ml及 penicillin G之最終含量為1000u/ml；若為供固體培養基用時上述液體中加1.5克Agar經高壓滅菌後冷卻至50℃時再加入20ml馬血清及1% phenol red 0.2ml及penicillin G。

B、Hofstad氏培養基
  雞的肉、心、肝抽出物 80 ml
  10%葡萄糖液 1 ml
  5% Thallium acetate 1 ml
  馬血清 20 ml
  1% phenol red 0.2 ml
  penicillin G 1000 單位/ml
上述成份充分混合後，經0.45μ及0.2μ過濾膜之過濾器過濾後置於4~10℃保存備用。若為供固體培養基用時，則於80ml之雞肉心肝抽出物加入1.5克Agar經高壓滅菌後，冷卻至50℃時再加入20ml馬血清及其餘的成份。
(2) 培養
A、 培養材料之處理：將採取冰存之試材，經回溫後除氣囊及肺材需經磨碎機磨碎成乳劑外，棉花棒之粘液試材置於37℃感作一小時，其間隨時加以振盪混合。
B、 試材之接種：將經37℃感作處理之試材取0.2ml接種至1.8ml液體培養液內，並以10倍稀釋至10-5。
C、 增殖繼代培養：將接種試材及經稀釋之培養液置於37℃恒溫水槽，經7~10天之振盪培養，其間並隨時觀察其pH值之變化，若已見酸變即刻繼代，若未見酸變者於7天後再次繼代直至3代。
D、 固體培養基培養：經液體培養基培養後（酸變者或未酸變之經液體培養基3代培養者）取0.2ml移植至固體培養基，經全面覆蓋於固體培養基面上，並把皿蓋稍為打開讓皿內之液體蒸發，俟乾燥後倒置於5% CO2，37℃培養箱內培養。
   
3. 菌落及菌形的觀察：
當黴漿菌於固體培養基上發育形成菌落時，由於其菌落較一般細菌所形成的菌落為小，故其形態很難以肉眼觀察，須經放大鏡或實體顯微鏡25~50倍率之觀察。
(1) 實體顯微鏡之觀察菌落：經固體培養基培養2日後，每日以25~50倍的實體顯微鏡觀察可見約0.1~0.5mm正圓形中心部呈圓形的核心，如荷包蛋樣的菌落，一般約需4~5天後才能見到M.gallisepticum之菌落形成。
(2) 菌落之雞血球吸著性觀察：M.gallisepticum特徵之一，係對雞血球之吸著性，將0.25%雞血球生理食鹽液，注入約1ml於已有菌落形成之固體培養基表面上，靜置約15分鐘，然後抽棄多餘之血球液再以生理食鹽水洗滌2~3次之後，置於25~50倍實體顯微鏡觀察，若為M.gallisepticum，則可見菌落上有雞血球被吸著。
(3) 黴漿菌的染色：
(a) 顯微鏡用玻片經拭擦乾淨後，將經培養之菌液塗在上面。
(b) 於火焰上慢慢使其乾燥，再漬於Bouin固定液中30分鐘。
(c) 流水中30~60分鐘水流沖洗。
(d) 以中性緩衝液稀釋成2倍的Giemsa染色液染色30分鐘。
(e) 再水洗，乾燥後，以油鏡觀察菌形，呈多形樣，如球形、橢圓形單個，甚至於2個連鎖形態。
   
4. 同定：
雞M.gallisepticum於同定上，除菌落形態大小及對雞血球之吸著凝集現象外，尚須以生化學及血清學的性狀同定之。
(1) 生化學性狀
A、 硫酸銨之絮狀反應
(a) 經液體培養基培養後之待測檢體，經遠心1000 rpm，30分鐘濃縮之沉澱菌體，並以燐酸緩衝食鹽液洗滌2~3次，最後配成原培養液之1/50倍濃度。
(b) 硫酸銨之15、20及25%水溶液，分別以3.2ml分注於試驗管中，再把濃縮之菌液分別以0.2ml加入。
(c) 各菌液與不同濃度之硫酸銨經充分振盪後混合置於55℃定溫水槽中感作10分鐘。
(d) 若為M.gallisepticum則於20%及25%硫酸銨溶液試管可見清晰的棉絮狀反應。
B、 TTC (Triphenyltetrazolium chloride)之還原試驗：M.gallisepticum對Tetrazolium有還原性，但較其他陽性反應者為遲。
(a) Heart infusion agar 74ml經高壓滅菌後，於冷卻至50℃時加入已過濾滅菌之馬血清20ml，10% (W/V)酵母抽出物5ml，2% (W/V)2、3、5-Triphenyl tetrazolium chloride (TTC) 1ml，經充分混合後以3ml分注小試管製成高層。
(b) 經18~24小時培養於液體培養基培養之檢體，以白金耳吊取該菌液穿刺上述高層TTC培養基內。
(c) 經37℃之培養於24~96小時培養觀察，若為陽性反應則呈紅色反應，陰性則其顏色不變，M.gallisepticum約需72小時以上始呈紅色變化。
C、 葡萄糖、阿金氨基酸及尿素之分解試驗
(a) 經高壓滅菌之Heart infusion broth (Difco) 222ml，馬血清30ml，10% (W/V)酵母抽出物15ml，0.5% (W/V) phenol red 3ml充分混合製成基礎培養基；另分別將葡萄糖、阿金氨基酸及尿素等被檢物質各配成10% (W/V)溶液；再將基礎培養基各取90ml，分別與各10ml被檢物質溶液混合，其中含有葡萄糖者pH修正為7.6，阿金氨基酸及尿素為7.0。再以2ml分注小試管。
(b) 經18~24小時培養於液體培養基培養之檢體，取0.1ml分別接種至上述各被檢物質培養基中，並加入0.2ml的凡士林．石腊(1：1)液重層之。
(c) 經37℃之一週培養，若有黃變則為陽性反應，陰性則其顏色不變，M.gallisepticum對葡萄糖為陽性，阿金氨基酸及尿素則呈陰性反應。
D、 Film and spots表面斑點試驗：
部份的黴漿菌於含冇卵黃的培養基表面上會形成斑點稱為Film and spots的特徵
(a) 將經高壓滅菌後之Heart infusion agar 75ml，於冷卻至50℃時加入馬血清5ml，Egg yolk emulsion (Difco) 10ml，25% (W/V)酵母抽出物10ml，分注於培養皿，製成固體培養
(b) 將被檢菌取0.5~1.0ml接種至上述固體培養基後令其全面覆蓋培養基面，置於37℃把皿蓋稍為打開，讓皿內之液體蒸發乾燥後，倒置於5% CO2 37℃培養箱內培養。
(c) 經37℃ 1~2週培養，若表面有紋斑存在即為陽性，否則為陰性，M.gallisepticum為陰性，而M.gallinarum為陽性。
E、 溶血性試驗：
部份黴漿菌對綿羊或天竺鼠之血液有溶血現象，此仍為其特性之一。
(a) Bacto-agar (Difco)以PBS配成1%溶液，修正pH為7.4，分注4.5ml於試驗管內經高壓滅菌之。綿羊或天竺鼠血液經PBS三次遠心洗條後配成50%溶液，取0.5ml加入前述寒天內輕輕搖動混合之，並維持50℃之溫度。
(b) 將於固體培養基上培養4~7天之菌落上，滴一滴上述之血球寒天液重層之，置於 35℃ 12~36 小時。
(c) 於每日取出於顯微鏡觀察前先置於4℃ 30分鐘，再以40倍觀察，於菌落周圍有綠色帶者為α溶血，若為透明帶則為β溶血，M.gallisepticum 為β溶血。
(2) 血清學的性狀：
黴漿菌之同定上，以對應之標準抗血清的作用與否，為最確實之準則。
A、 發育阻止試驗：
黴漿菌於培養基中培養時，若有對應之抗血清存在下，菌體被抗血清中和，其發育將受阻止，故可利用此現象以同定其種別。
抗血清的製作：
(a) 將標準菌株經液體培養基大量培養3~7天後 (3000~5000ml)，以30000 G三次遠心洗滌，濃縮成原菌液量的1/50~1/100倍之菌液，分注於小試管2ml置-70℃備用。
(b) 將濃縮抗原與等量的Freund complete adjuvant混合後以1ml皮內注射家兔；3週後抗原與等量的Freund incomplete adjuvant混合後，以1ml皮內注射；經3週後以不加adjuvant之抗原2ml腹腔內注射，1週後採血分離血清。
(c) 抗血清濾紙的製作：將直徑8mm之濾紙吸取標準抗血清後，置於4~10℃水箱內使其乾燥，然後改置於-20℃保存備用。
(d) 發育阻止試驗術式：待測檢體經液體培養基37℃ 24~48小時培養後，取0.5ml接種至固體培養基，令其全面覆蓋培養基面，置於37℃，把皿蓋稍為打開，讓皿內之液體蒸發乾燥後；把抗血清濾紙置於培養基面上，然後倒置於5% CO2，37℃培養箱內培養，經2~3天培養，觀察其發育阻止圈，若檢驗體與抗血清為同種時，則可見明顯發育阻止圈，否則無發育阻止圈形成。
B、 代謝阻止試驗：
黴漿菌於培養基中發育時產生代謝物質，將引起pH值之變化，致培養基中的色調有所改變，故於培養基中加入對應抗血清時，將阻止黴漿菌的發育，相對地其代謝活性也受阻，培養的色調變化也有受阻現象，故以此理可同定黴漿菌的種別。
(a) 代謝阻止試劑之配製：各以Hayflick之處方為基礎培養基【2.1% PPLO broth W/O cv (Difco) 7%；馬血液2%；25%新鮮酵母抽出液1%；Thalium acetate 1 : 2000；青黴素G 500 u/ml；phenol red 0.002%】分別加入被檢物質如1%葡萄糖，L-arginine，2,3,5-triphenyltetra zolium chloride等，並把pH調整至7.4~7.6，再分別以3ml分裝於小試管，置於4~10℃備用。
(b) 代謝阻止試驗術式：經18~24小時培養於液體培養基之檢體，分別以上述各被檢物質培養液稀釋成104 CFU/ml；同樣以各被檢物質培養液把抗血清依2倍釋稀法稀釋成40~640倍不同稀釋倍數；然後由不同稀釋倍之血清中各取0.25ml，黴漿菌稀釋液0.5ml，分別與各代謝阻止試驗用之培養液1.25ml混合之；經37℃，3~7日培養觀察，若有色變即為陽性反應。也即是檢體與抗血清為同種。
 
雞黴漿菌症血清學的診斷
 
1. 全血平板凝集反應：
(1) 抗原的製作
(a) 黴漿菌之增殖培養：凍結乾燥保存菌株，先以5ml的增殖培養液於37℃，3~4天培養後，移植至100ml，培養3~4天；最後再以3000~5000ml培養增殖7天。
(b) 黴漿菌之濃縮：經大量增殖的黴漿菌，以12000~15000rpm，30分鐘高速遠心，並經燐酸緩衝食鹽液依同法洗滌2~3次。
(c) 濃縮抗原的調配：將濃縮之菌體浮游之，其濃度調整成約為原培養液之1/50~1/100倍量。
(d) 凝集抗原之著色：將配成適當濃度之抗原中，加入0.01% sodium azide之防腐劑及結晶紫染色劑，經充分混合後，置於4~10℃水箱保存備用。
(2) 全血平板凝集反應術式：
(a) 將受測之雞隻採取之全血1滴與全血平板凝集抗原2滴，置於玻片上經充分的混合。
(b) 判定：於1分鐘之內呈現粗顆粒狀之凝集者為陽性，1分鐘至2分鐘出現較細之顆粒狀凝集者為疑陽性，否則為陰性反應。
   
2. 血清平板凝集反應：
(1) 抗原的製作
(a) 黴漿菌之增殖培養：凍結乾燥保存菌株，先以5ml的增殖培養液於37℃，3~4天培養，移植至100ml，培養3~4天；最後再以3000~5000 ml培養增殖7天。
(b) 黴漿菌之濃縮：經大量增殖的黴漿菌，以12000~15000rpm，30分鐘高速遠心，並經燐酸緩衝食鹽液依同法洗滌2~3次。
(c) 濃縮抗原的調配：將濃縮之菌體浮游之，其濃度調整成約為原培養液之1/50~1/100倍量。
(d) 凝集抗原之著色：將配成適當濃度之抗原中，加入0.01% sodium azide 之防腐劑及結晶紫染色劑，經充分混合後，置於4~10℃水箱保存備用。
(2) 血清平板凝集反應術式：將受測之雞隻血清1滴與平板凝集抗原1滴，置於玻片上經充分的混合。
(3) 判定：於1分鐘之內呈現粗顆粒之凝集者為陽性，1分鐘至2分鐘出現較細之顆粒狀凝集者為疑陽性，否則為陰性反應。
   
3. 試管內凝集反應
(1) 抗原的製作：黴漿菌種菌經液體培養基於37℃ 3~4天之大量培養後以12000~15000rpm，30分鐘高速遠心，並經燐酸緩衝食鹽液依同法遠心洗滌3次，最後配製成原培養液之1/10量菌液，加入0.01% sodium azide 防腐劑置4~10℃冰箱保存備用。
(2) 試管內凝集反應術式：將受測之雞血清稀釋成5倍，置於56℃ 30分鐘非動化後，再依二倍稀釋法稀釋成5~640倍；然後各加入等量的凝集抗原，經充分之混合後，罝於37℃恒溫槽內感作2小時後再改置於10℃一夜。
(3) 判定：血清最高稀釋倍數處呈現之凝集反應，即為該受測血清之抗體力價，血清稀釋倍20倍以上呈凝集者為陽性例，10倍者為疑陽性，10倍以下不呈凝集者陰性例。
   
4. 血球凝集抑制反應：
M.gallisepticum，因對雞血球有凝集之特性，於患禽之血清中，存有阻止該菌阻止血球凝集抗體，故應用該原理可測出雞隻是否有感染本症。
(1) 抗原之製作：M.gallisepticum經37℃，5~6天大量增殖培養後12000~15000rpm，30分鐘高速遠心，並經燐酸緩衝食鹽液洗滌2~3次後，配成適當濃度的菌液，並加入0.01%量的sodium azide ，置於4~10 ℃保存備用。
(2) 0.25%雞紅血球浮游液之配製：新鮮雞血液加等量Alsever液保存於4~10℃，經磷酸緩衝食鹽液，以2000rpm 10分鐘遠心洗滌3次後，再配成0.25%的血球浮游液。
(3) 血球凝集抑制反應術式
(a) 抗原之血球凝集價測定：使用96孔U字形微量塑膠凝集盤，保存於4~10℃之血球凝集抗原，以磷酸緩衝食鹽液依2倍稀釋法稀釋成2~4096倍後，加入等量之0.25%雞血球浮游液；置於室溫2小時後判讀其力價，以完全凝集之最高稀釋倍為其凝集力價，該最高稀釋倍數為一單位，進入本試驗時（即HI價之測定）則使用四單位。
(b) 受測血清的稀釋：以96孔U字形微量塑膠凝集盤，將受測血清以2倍稀釋法稀釋成 5~640 倍，其各孔之稀釋血清量為0.025ml。
(c) 抗原與受測血清之感作：於稀釋完成之受測血清中，各加入等量(0.025ml)四單位的血球凝集抗原液，經充分振盪混合後，置於室溫15分鐘感作。
(d) 0.25%雞血球之感作與判讀：抗原與受測血清經感作後，各加入等量(0.05ml)的0.25%雞血球浮游液，經充分振盪混合後，置於4~10℃水箱一夜，判讀，於血清最高稀釋倍數處為完全阻止血球凝集，為該受測血清之抗體力價，於80倍以上量完全阻止血球凝集者為陽性例。
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