野外豬瘟病毒人工感染 SPF 豬之試驗
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一、 病歷: 5 週齡第二代 SPF 豬行鼻口腔內 (IN & IO) 接種 106.5 TCID50 之 94-4 株 PK-CL 細胞增殖第三代豬瘟病毒株,於感染後第六天予以剖檢之,試驗豬臨床上除體溫呈高熱 (41.1℃) 外,無明顯症狀。 豬瘟病毒: 94-4 ,源自宜蘭縣轄養豬場,罹患豬瘟病例豬隻之肺臟乳劑,以 PK-CL 細胞分離所得。該場之疫情如下: 81 年宜蘭縣礁溪鄉某肉豬場,2 月齡豬隻,病發三天內皮膚呈紫斑及出血斑、發病五至六天部份豬隻陸續開始死亡。發病率為 136/1100,死亡率為 136/136。 該發病豬隻係自外購入,據查該場豬瘟免疫方式為哺乳前免疫,注射日期及疫苗批號皆不詳。購入後皆未再施行豬瘟補強注射。 二、 肉眼病變: 1.
脾 :輕度梗塞(圖 1)。 2.
淋巴結:腸間淋巴呈輕度周邊出血灶。 3.
腎 臟:腎臟散發點狀出血灶(圖 2)。 三、 組織病變: 1. 大 腦: 非化膿性腦炎不明顯,腦實質可見血管內皮細胞增生現象。 2. 脾 臟: 局部梗塞,血管內皮細胞增生,脾小結周圍成熟淋巴球顯著減少,而 改由網狀內皮細胞所取代(圖 3)。 3. 淋巴結: 成熟淋巴球顯著減少,髓質部可見小血栓形成。 四、 微生物檢驗: 1.
細菌檢查:採取病豬之肺、肝、脾、腦及膽囊等臟器於 TSA、Mac Conkey 及 DHL 培養基中培養,結果皆為陰性。 2.
血液檢查:
(1)血球計數:白血球總數為 9000 個 /mm3。
(2)血液抹片:Wright's stain 染色檢查,白血球呈核左轉現象。3.
病毒學檢查: (1) 病毒分離:試驗豬隻之各組織臟器,以含有 2% FCS 之 EMEM 培養液做成 X10 乳劑,將乳劑及血清接種 24 孔內之 PK-CL 細胞單層,在 36℃ 3% CO2 暖箱內吸著 2~3 小時,經培養液洗滌一次後,加入內含 2% FCS 之 EMEM 培養液。繼續培養三天後,以間接螢光(IFA)染色法判讀。 (2) PCR 診斷: 1. 引動子(Primers):針對豬瘟病毒的臺灣分離株、LPC 疫苗株、Alfort 株及 Brescia 株之核酸序列,經比對後,取其完全相同部份的核酸序列,設計一對引動子,可檢測所有之豬瘟病毒。 並就比對後的核酸序列,於差異之鹼基數最多處,設計一對引動子, 是為 LPC 特異性引動子,僅能檢測 LPC 豬瘟疫苗株病毒。 2. 方法: (1) 試材核酸之製備:各試材,分別取 0.2ml 置於 1.5ml 微量管中,再加入泰柔 RNA 萃取試劑 1ml,經震盪 30 秒後靜置於室溫中 5 分鐘,再加入 0.2ml 之氯仿,充分混和後於室溫中靜置 3 分鐘,再以 12,000rpm、4℃ 離心 15 分鐘,隨即取其上清液裝在另一支滅菌之微量管中,並加入等量的異丙醇,充分混合後再靜置於室溫中 10 分鐘,然後以上述條件離心 20 分鐘,去除上清液後再加入 0.1ml 絕對酒精,以同條件離心 5 分鐘,再去除上清液後以真空離心乾燥,再加入適量經 DEPC 處理過 之一次蒸餾水即完成核酸製備。 (2) 合成第一股 cDNA 及聚合脢鏈反應:將各試材之核酸溶液,分別裝於 0.5 毫升的微量管中,並加入 10ul 之 10 倍 DynaZyme 緩衝液(含 500mMKC1、100mMTris-HC1,15mMMgC12,0.1%Triton X-100)、0.02 微莫耳鹼基(dATP,dCTP,dGTP 及 dTTP 各為 1.25mM)、16 單位 RNasin 、 2.4 單位 AMV 反轉錄脢、 2 單位 DynaZyme 聚合脢及經 DEPC 處理過之二次蒸餾水,再加入0.01 nanomole 引動子。每管反應溶液之體積為 100 微升,混合圴勻後, 上面覆蓋適量之礦物油。整個反應是在熱循環器(Perkin Elmer Cetus DNA Thermal cycler)中進行,先以 42℃ 進行 40 分鐘之反轉錄作用,隨即進行 PCR 反應。 (3) 洋菜膠片電泳分析:分別取 10 微升(ul)PCR 產物與 1 微升(ul)的膠片載入緩衝液 (gel loading buffer)混合後,以 2% 洋菜膠片電泳分析,此一膠片是以 TAE 緩衝液泡製而成,其中包含溴化醯液(ethidium br omide)每毫升 0.5 微克(ug),經 100 伏特電壓電泳 20 分鐘,以 DNA -100bp-Ladder 當作分子量標記。 3. 結果:豬體內各臟器,以 AHC3.4 引動子測試若為陽性反應者,均可產生 459 個鹼基對的產物;以 HCT31.32 引動子測試結果為陽性反應者,則可得到 439 個鹼基對的產生。 五、 診斷: 豬瘟(Hog Cholera) 六、 討論: 1.
本病例之發生可能原因:發病豬隻皆為自外購入者,且購入後未即時予補強注射,可能導至豬隻豬瘟抗體低下,而該豬場為一老舊豬場,豬舍設備及環境皆差,豬舍出入口亦無消毒槽之設施,出入人員管制鬆散,病原可能由此帶入,再加以抗體過低不 足以保護豬隻故而發病。
該病毒株以 PCR 技術偵測結果為野外病毒株,接種家兔亦無熱反應現象 ,經人工感染試驗結果,可初步得知本野外病毒株非屬強毒株及 LPC 疫苗株 。2.
PCD 6 剖檢腦組織病變不明顯,典型之豬瘟病變須待豬瘟病毒二次增殖,經病毒血症傳播至全身才能引發典型病變。本病毒株 94-4,經人工感染試驗其中一頭於 PCD 12 時剖檢可見典型非化膿性腦炎病變。