螢光顯微鏡檢查法
- 內容
一、螢光抗體的原理
螢光抗體法 (Fluorescent Antibody Technique) 為應用組織化學及免疫學的方法，在螢光色素物質結合抗體的幫助下，使特異的抗原抗體複合物 (Antigen-Antibody Complex) 顯現在組織切片或細胞塗抹片，因此本法主要靠螢光色素及紫外光源。螢光色素是一種以紫外線激發照射而放出更長波長的物質。當一種物質被激發而發光叫做螢光。如果能源被切斷仍繼續發光，叫做燐光 (Phosphorescence)。螢光物質能標附或結合於抗體球蛋白而不干擾其免疫學上的特異性及其結合抗體的能力。
螢光抗體直接法可應用於任何抗原的物質，不管在細胞內或細胞外、原蟲、細菌、立克次氏體、病毒、組織抗原、激素或酵素。
另一種為螢光抗體間接法，是以未經標示之已知抗體和已知或未知抗原反應。這個抗體叫做第一次抗體 (First Antibody)，第二步再以標示之特異抗球蛋白抗體 (Second Antibody) 來染。如果有特異螢光出現，即可間接證明第一次抗體已與特異抗原結合。
還有一種為補體法，則以螢光標示之抗補體抗體來染 " 抗原－抗體－補體複合物 "(Antigen-Antibody-Complement Complex)。(一) 螢光抗體法的特性
(The Characteristics of Fluorescent Antibody Technique)1. 特異性 (Specificity)
和螢光色素結合的抗體球蛋白是一種對抗原有很高特異反應性的蛋白，因此，標示抗體僅和特異相對抗原 ( 細菌、病毒、組織或細胞 ) 反應，且亦可知道病毒在細胞之位置及包涵體 (Inclusion Body) 和病毒顆粒之關係。2. 迅速性 (Rapidity)
染色步驟及螢光顯微鏡觀察能於 1～2 小時內完成。故如豬假性狂犬病、豬瘟、狂犬病或其他已有標示抗體者，當病材送達後，1～2 小時即可知是否受到該病的感染存在。如果標本內可檢出抗原即可以肯定的做診斷，這比培養或動物接種更節省時間。但是若為陰性，必須與其他診斷法併用來做最後診斷。3. 敏感性 (Sensitivity)
螢光抗體之敏感性和 ELISA 法很相似，而高於中和反應及血球凝集反應試驗。由於特異螢光的強度無法定量，故未能實際估計其敏感性。以間接法而言，僅第一次抗體 2 單位即能檢出抗原 ( 若抗原量足夠 )。此外本法之敏感性亦受抗原量之多寡影響。Coons(1956) 曾報告最少必須 0.8×l0-4μg/mm2 的肺炎球菌莢膜多醣體的濃度，才能以螢光抗體檢出。Pressman et al.(1958) 謂 5μ 的組織切片中，其能檢出之抗原濃度約為 1.4×l0-4μg/mm2。螢光抗體法之間接法及補體法之敏感性約比直接法高 5～10 倍。(二) 必要條件 (Prerequisites) 1. 抗原 (Antigen)
材料的準備必須儘量避免能和抗體反應之抗原的損失。材料之前處理及固定必須能移去脂肪或其他干涉「抗原－抗體」反應的物質，且不影響抗原物質固定於玻片。有時，固定作用會破壞抗原性與增強自發及非特異螢光，而未處理之材料因保持抗原性反而較易於觀察，因此染色必須有對照材料以資比較觀察。2. 抗血清 (Antiserum)
非常強而特異的螢光抗體往往帶很弱之電荷。抗血清之力價必須很高，須不含被檢組織之抗體或含量很低。抗血清中所含之對抗正常組織的抗體，必須由該組織或由丙酮乾燥製備之天竺鼠肝粉來處理吸收掉。若抗體之力價很高，則可稀釋抗體來降低所含之其他抗體的干擾。製備抗體之免疫動物必需使用SPF動物來增加抗體之特異性。標示後的抗體必需經過 DEAE-Cellulose(0.14 M NaCl 在 0.0l M Phosphate buffer pH 7.3) 除去多帶 FITC 之抗體。3. 標示抗體 (Labelled Antibody)
本法中所使用之螢光色素物質和抗體球蛋白很容易結合，其穩定性高，不會影響抗體之結合反應，具有相當好的適量範圍 ( 螢光色素效率 )，且最高吸收及最低放出之波長有很大不同。4. 反應的條件 (The Condition of Reaction)
螢光抗體之稀釋、作用溫度、緩衝鹽水之濃度、pH 值及水洗等都要小心控制，染色價必須事前由已知含量之抗原材料來測定，且染色液必須含 2～4 倍染色價。5. 對照 (Control)
為確保染色反應之特異性，必須有下列的對照：(a) 抗原：(1) 正常未感染組織 (2) 含特異抗原之組織或 (3) 其他特異性抗原之組織。必須對照組之 (1) 及 (3) 都沒有螢光出現，而 (2) 卻有螢光出現。 (b) 抗體：在抑制試驗中，以標示異質性抗體染色者應為陰性。 6. 觀察 (Read)
螢光顯微鏡須有上面照光裝置 (Epi-Iliuminater)、暗視野聚光器 (Dark-Field Condenser)、Xenon Lamp 或高壓力之水銀燈，多種濾光器及照相裝置。紫外線的調整、濾光鏡及聚光器的選擇以及被檢材料暴露觀察時間等是否正確，都要注意，否則會影響判讀之結果。(三) 螢光抗體法遇到之困雞 1. 自體螢光 (Autofluorescence)
組織或細胞產生之自然螢光 ( 即自體螢光 )，為白色或藍紫色，和特異螢光極易區別。較厚之組織切片易出現自體螢光。經福馬林固定及石蠟包埋處理後亦易引起。2. 外源特異螢光 (Extraneous Specific Fluorescence)
當免疫原不純時 ( 即有其他抗原污染，如蛋白質、異質性抗原或該動物感染其他微生物 )，會發生此型之螢光。一般以正常組織粉末未能吸收之。例如：以自然感染 Sendai Virus 的小白鼠用於製造抗日本腦炎血清而以 FITC 結合，並應用來測定病毒抗原之位置時，會造成未感染日本腦炎病毒之呼吸道細胞，卻有特異螢光出現之現象，故一般皆以 SPF 動物製造特異抗體，或以單源抗體 (Monoclonal Antibody) 做特異抗體。3. 非特異螢光 (Nonspecific Fluorescence)
非特異螢光可能來自未結合且未被除去之多餘標示色素、抗體結合太多的色素、組織固定之不當或材料染色過程中乾燥掉。小心控制球蛋白及 FlTC 之濃度、反應時間、溫度、Gel Filtration 及 DEAE－cellulose 行 Column Chromatography (0.14 M NaCl in 0.0l M Phosphate Buffer，pH 7.3) 等條件，所得之染色結果非特異性最少，而其 Fluorcein / Protein Ration 為 ≦ 2.5 其算法如表一。以紫外線之吸收來計算 FITC Conjugates 之公式如下：
Con. of FITC－Protein(mg/ ml)＝OD 280－(0.36×OD 496)
－－－－－－－－－－－
1.4二、標本之製作
(一) 玻片及蓋玻片 (Slide and Coverslips)
玻片及蓋玻片品質必須很好而沒有螢光，玻片厚度 ≦1.0mm 者便可用，玻片之清洗，必須以中性清潔劑洗淨，再浸於含有 3％HCl 之乙醇 12～24 小時，然後再儲存於純酒精。要用時，以清潔紗布擦淨或火焰烘乾。用完後可浸於水中，移去封埋物，再經清潔劑及重酪酸－硫酸混合物＊處理。
＊重酪酸一硫酸混合物之配法：
粗製重酪酸鉀 300 gm
20％ 硫酸水溶液 3000 ml
使用琺瑯質或陶質容器，先放入 20％ 硫酸水溶液，然後緩緩加入粗製重酪酸鉀，以玻璃棒攪拌，此時會發熱，俟冷卻後使用。
目前已有處理好的玻片出售，使用上甚為方便。(二) 組織切片 (Tissue Sections)
組織切片愈薄愈好 (4μ)，如果切片太厚，則可能自體及非特異螢光增加，目前都用冷凍切片機 (Cryostat) 來切，冷凍切片機包括冰凍櫃 (Refrigerated Cabinet)，溫度在 0℃～-30℃ 之間，切片機 (Microtome) 放在裡面，將組織在 -20℃ 冰凍 10 分鐘，就可以切，切下之薄片，以玻片捺下後在室溫急速乾燥。製備好之切片必須儘可能馬上固定及染色。如果切片必須儲放短時間 ( 約 1 週 )，則固定後密封儲放於 -70℃，要染色時，切片必需回溫到室溫方啟開。(三) 細胞培養法 (Cell Culture Preparation)
細胞培養法一般用蓋玻片在組織培養盤 ( 例如 24 孔 )或培養在玻璃片 (Chamber Slide) 上，再和普通接種病毒一樣，接種可疑病材乳劑，培養數天，取出，乾燥、固定、水洗，再用標示抗體染色以檢查特異螢光。(四) 塗抹法或捺壓法 (Smear and Impression Preparation)
所用玻片需很薄，一般用蓋玻片代用，將所要檢查之病材，如血液、組織液或其他病材，在玻片上塗抹或捺壓，塗抹或捺壓片在室溫用吹風機或電風扇 ( 以冷風吹乾 )，以甲醇或丙酮固定，放於密封標本箱於 -20℃ 備染或馬上染色。(五) 固定 (Fixation)
除了使組織固定於玻片外，另一方面亦可助抗原－抗體複合物之形成，例如把脂質溶解，使抗體抗原較易反應。一般用 100％ Methanol 在室溫作用 2 分鐘，或丙酮於 -20℃ 下 10 分鐘來固定微生物抗原及病毒。三、染色法 (Staining)
染色法可分為直接法、間接法及補體法。(一) 直接法 (Direct Method)
用標示抗體直接染色，其步驟如下：將塗抹片或捺壓片或冷凍切片經甲醇 (2 分鐘 ) 或丙酮 (10 分鐘 ) 固定後，放於 PBS 內振盪，水洗幾次後，除去多餘水分，而滴 2～3 滴螢光標示抗體，然後放入塑膠盒中，置於 37℃ 恆溫箱 30 分鐘後，甩除染色液而以 PBS 振盪水洗 2 次，換液放置 10 分鐘，以 50％PBS-Glycerine 緩衝液包埋後鏡檢。茲將其圖示如下：
此法之優點是非特異性甚微或無，但是對被檢抗原之各種抗體須全部製成標示抗體，但標示抗體製成後，檢查則甚方便。
(二) 間接法 (Indirecct Method) 此法是抗原先與一次抗體結合後，再和對應一次抗體的二次螢光標示抗體結合，一般將特異抗原注入健康兔子以產生高度免疫血清，再將兔之免疫血清純化所得之 IgG 打入山羊，所得之抗 IgG 血清再經螢光色素處理成標示抗體。塗抹片或組織培養之 Coverslip 單層細胞或冷凍切片以一次抗體覆滿，放於塑膠盒，在 37℃ 感作 30 分鐘，經 PBS 水洗，再經二次標示抗體染色 30 分鐘，( 放於塑膠盒，37℃)，然後以 PBS 再水洗，乾燥，封埋，鏡檢。茲將其圖示如下：
此法之優點是標示物為抗 IgG 抗體，而此種標示抗體可應用於該動物之各種疾病之診斷，應用甚廣。
(三) 補體法 (Complement Method) 本法以螢光色素處理抗天竺鼠補體血清，而成標示之抗補體抗體來染色，其圖如下：
四) 對照 (Control)
螢光抗體法用來診斷抗原－抗體反應必須有對照。在抗原對照中，需將固定處理後之正常及感染組織一起染色，以瞭解組織中是否含有不須染色之他種抗原。在直接法之抗體對照中，(a) 抑制試驗需成功，(b) 不同性質抗體含未感染及未免疫之同質標示抗體必須沒有螢光出現，(c) 同性質抗體以特異抗原吸收後，必需沒有螢光出現。在間接法及補體法中，亦需做相同之對照。在間接法，除了要觀察有無非特異性螢光外，以 PBS 或生理食鹽水稀釋之不同性質抗體及正常血清代替一次抗體之對照試驗，應無螢光出現。在補體法，須做更多組織對照試驗。
四、標本之保存與照相
一般染色之標本，應立即觀察，因當時螢光最顯著；若不能馬上觀察，須儲存於乾燥盒 (Polyethylene Bag) 內，有時在 0～5℃ 儲存，可保存一個月左右，仍可呈現特異螢光。
在螢光顯微鏡之紫外線照射下，染出之特異性螢光會很快消失，故要照相存證者，須於材料新鮮時染色，並馬上照相，才會有好效果。若使用自動相機拍照，則底片以 Kodacolo r(ASA 100) film 為宜，儀器則設定為 ASA 400，照完後送洗時應指定以 ASA 400 沖洗。以此相片再使用適當之正片底片 (Kodak#5072) 照相，此時應改變不同曝光時間的長短而選最好的片子。
五、螢光顯微鏡之操作及維護
(一) 先開電源 (0N)，起動發光器，再開照相機電源。以免先開照相機再開螢光顯微鏡電源時，強大電源將照相機電子零件燒損。 (二) 選擇濾鏡，將濾鏡推入 ( 以免光線向外散失 ) 後，於暗室下開始觀察。應一次把全部玻片觀察完畢，勿中途切斷電源，否則須待冷卻後 ( 約 30 分鐘 ) 才能再開電源。最少開機 30 分鐘才關機，以免縮短燈泡壽命。 (三) 螢光色素於普通光線照射下易消失，故未觀察之標本宜置不透光盒內儲存於冰箱 (4～5℃)。而在螢光顯微鏡之紫外線照射下亦易使螢光消失，故照像時宜速。 (四) 本省氣候潮濕，存放螢光顯微鏡之暗室應有除濕設備，並每星期將螢光顯微鏡至少開機一次，以免顯微鏡發霉損及鏡頭與濾光鏡。
六、冷凍切片及螢光標示抗體染色之要點
(一) 冷凍切片標本製作 (The Preparation of Frozen Section)
採 取 病 材 依疾病之不同，採取適當部位冷凍或冷藏後送到實驗室。 ↓
組 織 塊 製 作將組織切塊成長×寬×厚約 1.0cm × 0.5cm × 0.3cm 之組織塊，並以水黏附於標本座上。 ↓
冷 凍 切 片將組織塊置於 -20℃ 冷凍 10 分鐘後切成厚約 4～8μ 之薄片，以玻片取下。 ↓
乾 燥玻片標本以吹風機急速於室內溫吹乾。
↓
固 定以純甲醇於室溫固定 2 分鐘，或以 -20℃ 丙酮固定 10 分鐘。以吹風機急速乾燥或浸泡 PBS，上下振動玻片以除去固定液。 ↓
螢光標示抗體染色(二) 直接法及間接法螢光標示抗體染色
(Direct & Indirect Immunofluorescence Assay )
組織冷凍切片材料 病材乳劑接種細胞培養後之材料 
固 定
甲醇 2 分鐘，或 -20℃ 丙酮 10 分鐘。
↓
清 洗
將玻片浸泡於 PBS 中，上下振動 5 次。換新 PBS，再上下振動 5 次。
置於 PBS 中浸泡 10 分鐘。( 共換三次 PBS)
直接染色法 特異螢光標示抗體 0.1ml 覆蓋標本，
37℃ 染色 30 分鐘。必須預防乾燥。
↓
清 洗
( 以 PBS 清洗 3 次 )
↓
包 埋
(PBS：甘油 ＝１：１)
↓
螢光顯微鏡觀察間接染色法 以 PBS 適當稀釋第一次抗體 ( 對已知抗原有特異之抗血清 )，取 0.1ml 覆蓋標本，37℃ 染色 30 分鐘。必須預防乾燥。 ↓
清 洗
( 以PBS 清洗 3次 )
↓以 PBS 適當稀釋第二次抗體 ( 結合抗該種動物 IgG 之FITC；例如山羊抗豬 IgG- FITC)，以 0.1ml，覆蓋標本，37℃ 染色 30 分鐘。必須預防乾燥。 ↓
清 洗
( 以 PBS 清洗 3 次 )
↓
包 埋
(PBS：甘油 ＝１：１)
↓
螢光顯微鏡觀察參考文獻：
1. 台灣省家畜衛生試驗所．1977．獸醫實驗室檢查法手冊，台灣省家畜衛生試驗所．淡水鎮。 2. 國立預防衛生研究所學友會．1973． 實驗學總論．丸善株式會社，日本。 3. Bullock G.R. and Petrusz P.1987. Techniques in Immunocytochemistry. Academic Press, Inc. USA. 4. Carter, G. R. 1973. Diagnostic Procedures in Veterinary Microbiology. Charles C Thomas. USA. 5. Finegold S.M. and Martin W.J. 1982. Bailey and Scott's Diagnostic Microbiology.
The C. V. Mosby Company. USA.6. Miroslav Ferencik 1993. Handbook of Immunochemistry. Chapman & Hall. UK