十三、茨城病
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(一)病名及病原
1.病名：茨城病 (Ibaraki disease)
2.病原：係由黑臭病毒科 (Reoviridae) 之環狀病毒 (Orbivirus) 感染引起的牛隻傳染病。
(二)疾病簡介
本病於 1959-60 年在日本大流行時，才由發生地茨城縣初次分離到病毒，故取其地名命名為茨城病毒。本病毒為球形，其大小約 50nm 顆粒。茨城病發生的國家僅日本及韓國而已，在日本於 1959-60 年發生時，發生頭數有 39,000 多頭，發病率 1.96﹪，死亡率 0.2﹪，致死率達 10.3﹪。筆者於 1987 年至 1990 年間每年調查本省年群之中和抗體陽性率分別為 25﹪、42﹪、48﹪及 90﹪。並在 1990 年 7 月首次從嘉義縣病牛中首次分離到病毒，證明本病在台灣已有發生。
本病病程頗類似牛流行熱，又因為本病病原與藍舌病的病原有抗原性的交叉反應，故對先進國家的養牛事業是被認為惡性之外來傳染病而受重視。
(三)典型之臨床症狀及病理變化
本病多發於初夏至晚秋，雨季，且地形上處於低窪多濕地區亦較易發生本病，本病的特徵乃病毒感染後 7-14 日突然引起嚥下障礙，在感染初期呈輕微之發熱 (37-40℃)，精神及食慾減退、流淚、眼結膜的充血與腫脹、水樣或膿樣鼻汁、泡沫性之流涎，重病例於眼結膜或舌頭會腫脹、並伸出口外、鼻鏡、鼻腔內及口腔粘膜呈鬱血、充血或壞死。鼻鏡有痂皮。蹄冠部潮紅、腫大潰瘍及疼痛而跛腳。筆者所見的病例多呈流鼻汁，並未發現咽喉頭及舌麻痺，但是外陰部可見充血、腫脹、潰瘍及乳頭潰瘍，病樣可能是某種牛糠蚊，如 Culicocides nipponesis、及C.oxystoma 等。
嚥下障礙的病例，食道由漿膜至肌肉層可見出血及水腫，上部食道壁遲緩，肌層的灰黃色化。第 1 胃至第 3 胃內容物之乾燥，第 4 胃粘膜呈充出血、水腫、糜爛及潰瘍，各臟器呈出血或水腫，如誤嚥食物者，其臟器出血或有壞死性病灶。呼吸困難的病牛其鼻粘膜或口粘膜呈充血、水腫、缺損、痂皮化，同時發生誤嚥性肺出血、壞疽。 鏡下，引起嚥下障礙牛之食道，漿膜至肌層間有出血及水腫，橫紋肌玻璃狀變性，組織構造消失，纖維芽細胞增多，變性之橫紋肌呈融解消失，結蹄組織細胞增多，其他尚可見心臟內外膜出血，心肌壞死與腎出血。
(四)應採病材
發現牛隻有呼吸症狀及流鼻液的現象可以採集鼻液及加抗凝劑的血液供病毒分離。牛隻若解剖檢查時，應採集氣管、食道、肺臟、脾臟、腦組織製成乳劑以供病毒分離。
(五)綜合診斷
1.茨城病病毒之分離與同定
病毒分離用細胞：主要使用 HmLu-1 及 BHK-21 繼代細胞。細胞培養用培養液是以 Eagle's MEM，添加 8﹪胎牛血清，並以 7.5﹪NaHCO3 調整 PH 為 7.0-7.2。以 24 孔組織培養盤先行培養形成單層細胞，於接種前以無菌 PBS 或 MEM 清洗細胞，然後接種 0.2ml 臟器的乳劑上清液或是血球液，在 37℃5﹪CO2 的恆溫箱中進行吸著作用 30 分鐘。再將乳劑吸出後以 PBS 清洗細胞 1 次，然後加入含 2﹪Bovine Serum Albumin 及 10﹪Tryptic Phosphate broth( 以 7.5﹪NaHCO3 調整 PH7.0-7.2) 的細胞培養液 1ml 再送入 37℃，5﹪CO2 的恆溫箱中培養，並觀察 2-7 日看是否有細胞病變產生。初代分離若沒有細胞病變產生，必須再做 2 至 3 次繼代。而有細胞病變產生之上清液可進行電子顯微鏡檢測，或是血清中和試驗作為診斷依據。
(1)電子顯微器檢測： 從接種乳劑產生細胞病變的細胞上清液，先以 3,000rpm 離心 30 分鐘去除雜質，然後再以超高速離心 10 分鐘 (90,000rpm 氣動式離心機 )。取出沉澱物經負染色後，以電子顯微鏡檢測有無病毒顆粒。茨城病病毒的型態為球型，病毒顆粒大小為 50nm。
(2)血清中和試驗檢測： 將分離的病毒株進行 10 倍序列連續稀釋後，加入抗茨城病病毒的標準血清進行中和試驗，以血清中和的病毒力價和未加血清的病毒力價比較，以證實病毒是否受標準血清中和，而判定分離的病毒是否為茨城病病毒。
2.免疫學診斷方法
牛隻一旦受到牛茨城病病毒感染後，其體內會產生抗病毒之特異性抗體，故檢測牛血清中是否有抗體就可診斷牛隻是否已感染病毒。介紹下列二種方法供檢測牛茨城病抗體：
(1)中和試驗：
測試中和抗體之前先要準備一批試驗用病毒，測試其病毒力價，然後小分裝保存於 -80℃ 冰箱中，待每次作中和試驗時取出稀釋使用。受測試的血清必須先經非
化 ( 在 56℃ 水浴槽浸置 30 分鐘 )，以去除非特異反應因子。取血清 0.05ml 和稀釋液 (MEM)0.05ml 混合在無菌平底培養盤上做兩倍序列連續稀釋，並對每一個稀釋倍數做 4 個重覆，然後加入 0.05ml( 含 200TCID) 的病毒液，經震盪混合均勻後，再送入 37℃5﹪CO2 之恆溫箱進行感作 1 小時。經感作後加入 0.1ml 含 3×105 個細胞的細胞懸浮液，並震盪混合均勻，再以透明膠帶封住，置入恆溫箱培養觀察。經觀察 7 天後以形成單層細胞但未產生細胞病變的最高稀釋倍數換算為血清中和抗體力價。並以抗體力價大於或等於 2 倍而判定為牛茨城病抗體陽性。(2)血球凝集抑制法試驗 (Hemagglutination Inhibition test；HI)
牛茨城病病毒經證實可對牛的紅血球有凝集性，因而可藉此特性進行血清學的 HI 力價測試，以證實有無抗牛茨城病的抗體，而可檢測出是否受病毒感染。 該試驗所用之病毒抗原是以 HmLu-1 細胞增殖病毒後濃縮而成。試驗時先進行病毒凝集抗原的力價測試，所用的抗原稀釋液是磷酸緩衝鹽水 (PBS，pH＝8.2) ( 附錄 1)，進行 2 倍序列連續稀釋 ( 附錄 2)，再加入 0.5﹪以磷酸緩衝鹽水 (VBS；附錄 1) 稀釋的牛紅血球懸浮液，經震盪後放置在 4℃ 過夜反應後判定抗原紅血球凝集力價。而進行血清 HI 反應是用 4 單位的紅血球凝集力價。 牛血清在進行 HI 測試前須先經白陶土乳劑處理以去除非特異反應物質。處理方法是取被檢血清 0.2ml 於小試管內加血清稀釋液 0.3ml，以 56℃30 分鐘加溫非化。然後再加入 0.5ml 的 25﹪v/v 白陶土乳劑 (以 PBS，pH＝8.2 泡製 )，在室溫中震盪處理 30 分鐘，再以 3,000rpm 離心 15 分鐘，取其上清液供為試驗。經此處理過的血清是為 5 倍稀釋液。 處理過的血清以 PBS 稀釋液做 2 倍序列連續稀釋 ( 附錄 2)，及加入含 4HA 單位的病毒液 0.025ml，經震盪均勻後放 在37℃ 感作 60 分鐘，然後才加入 0.5﹪牛紅血球懸浮液 0.025ml，經震盪均勻靜置在 4℃ 過夜反應後判定。以抑制病毒凝集血球的最高稀釋倍數定為 HI 力價。並以 HI 力價大於或等於 10 倍而判定為牛茨城病抗體陽性。
3.病理學診斷
發病牛隻檢查其食道、咽喉頭以及舌橫紋肌可發現變性、壞死、淋巴球浸潤的病灶，而在病灶區也可見纖維芽細胞之增殖和肌漿膜細胞之腫大及增加的病變。另外在心內外膜之出血和心肌變性，也可以在部份病例中發現。
(六)確診依據
發病牛隻的病原分離以及病死牛隻的解剖病變是確診依據，但牛隻發病期間的配對血清抗體反應也可供診斷依據。
(七)參考文獻
1.吳永惠 (1989) 牛病學藝軒書局 台北市 pp.83-85.
2.Campbell C.H., Barber T.L. and Jochim M.M. (1978) Antigenic relationship of Ibaraki, Bluetongue and Epizootic hemorrhagic disease viruses. Vet. Microbiol., 3：15-22.
(八)附錄
1. 血球凝集抑制法中試驗藥配方
(1)基礎液
A 液 0.20M 磷酸二氫鈉液 NaH2PO2.2H2O 31.20 g/1,000ml B 液 0.20M 磷酸一氫鈉液 Na2HPO2.12H2O 71.62 g/1,000ml C 液 0.04M 磷酸緩衝液 pH8.2 由 A 液 4ml 與 B 液 96ml 混合為 100ml，再加精製水至全量為 500ml。 D 液 2.0M 氯化鈉液(2)抗原及血清稀釋液 (PBS)1,000ml 中 C 液 ---500ml D 液 ---300ml 精製水 --- 殘餘量(3)紅血球懸浮用液 (VBS)1,000ml 中 A 液 ---150ml B 液---850ml 牛白蛋白 ---2g
2. 牛茨城病病毒抗原之 HA 與 HI 反應
(1)紅血清懸浮液調製法：以抗凝劑 (Alserve) 採集鵝血液，經棉花濾過後將血球液以 2,000rpm 離心 5 分鐘後去除血漿，再加入生理食鹽水至原來體積量震盪均勻後以 2,000rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，經 3 次同樣步驟清洗血球後，取洗淨之紅血球層液和 VBS 液製成 0.5﹪v/v 牛紅血球懸浮液供為 HA 和 HI 試驗用。
3. 注意事項
(1)溶解的抗原及標準血清要儘速使用。
(2)對茨城病毒之 HA 價依牛個體別其血球的凝集價有顯著差異，應使用具 HA 價的牛紅血球。
(3)HA 及 HI 反應要用 96U 孔字型之微量塑膠盤。