藍舌病(獸醫科技資訊網)

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藍舌病

內容

目的

藍舌病鑑定標準操作程序（以下簡稱本標準）所制訂之內容係提供於實驗室處理相關病材，進行藍舌病之鑑定操作時所必須之程序，以確保檢驗水準之一致。

名詞定義

1.	藍舌病：
	藍舌病（bluetongue，簡稱 BT）為綿羊和家畜以及野生反芻類動物的一種藉著昆蟲傳播的病毒性傳染病，接觸不造成感染。臨床症狀在家畜類反芻動物非常罕見，通常僅見於綿羊和某些野生反芻動物。症狀範圍可由急性到不顯性都有，炎症引起之發熱、充血，導致顏面的水腫、出血和黏膜的潰瘍。有時舌頭呈現劇烈的充血，因腫脹、水腫而伸出口外。充血也會延伸到身體其他部位，尤其是腹股溝、腋部及會陰。常出現嚴重的肌肉變性。蹄冠炎、腳冠狀帶的炎症骨骼肌病等引起綿羊的跛足。

2.	藍舌病病毒：
	藍舌病病毒屬於里奧病毒科（Reoviridae）環狀病毒屬（genus Orbivirus）中之一員，該屬病毒計有 14 個血清群（serogroups），藍舌病病毒為其中之一，而藍舌病病毒本身則有 24 個血清型（serotypes）。每一血清群之中均有相同之病毒蛋白，可以免疫學試驗加以檢測區別。絕大部份的血清群均可以血清學加以區別，但是藍舌病與鹿流行性出血症（EHD）兩者有交叉反應。血清群組中各個病毒之血清型別則以中和試驗加以鑑別。完整之藍舌病病毒顆粒為雙層構造，外層含有二種蛋白，其中之一即為決定血清型之較大蛋白。內層之二十面體核心含有二種較大蛋白，三種較小的蛋白，十條雙股 RNA，VP7 是較大核心蛋白中具有確定血清群之抗原。病毒之鑑定傳統上是靠細胞培養分離病毒，然後進行血清群組及血清型別之試驗。最近，應用聚合鏈反應（PCR）技術可將病材中藍舌病病毒，非常快速的加以增幅。以 PCR 為基礎之步驟目前也可提供血清群與血清型方面之訊息。
	反芻獸於感染藍舌病病毒後，約 7～14 天會出現血清學方面之反應，並維持一段相當長的時間。藍舌病血清群別 ( serogroup-specific) 之抗體可以膠內免疫擴散反應 ( AGID) 和間接酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA) 加以檢測，但是無法和鹿流行性出血症區別。單源抗體競爭性 ELISA 法的出現，解決了前述的困擾。血清型之鑑定因需以中和試驗對全部 24 個血清型加以比對，非常繁瑣不便。

設施及材料

(1)

實驗室：符合國家安全標準III級實驗室

(2)

高速離心機：Kubota 1300

(3)

離心機：Hermle ZK364 , Jouan C412

(4)

桌上小型離心機：KM-15200, Kubota

(5)

顯微鏡：Zeiss, Germany

(6)

恆溫箱：SHEL LAB model TC2323

(7)

水浴槽：Hotech, water bath 810

(8)

ELISA kits：澳洲TrapBio 出品。

(9)

ELISA reader：MRX 美國出品。

(10)

藍舌病抗體檢測試劑AGID：VMRD,Inc. USA 出品。

(11)

細胞培養液：每包 1 公升裝 MEM 鹽基粉末(Gibco) 加入滅菌再製蒸餾水至 1 公升。經溶解後加入 2.3 gm 的 NaHCO₃，以 0.22μM Millipore 過濾並分裝於 500 mL血清瓶內，TSA Agar無菌檢定通過後放入 4 ℃ 冰箱保存備用。

(12)

細胞生長液：
每100 mL MEM 細胞培養液內加入8 mL 胎牛血清 (8 %) 及抗生素 (penicillin 100 U / mL和streptomycin 100μg/ mL)，供細胞增殖培養用。

(13)

細胞維持液：
係於每 100 mL MEM 細胞培養液內加入 2 mL 胎牛血清 (2%) 及抗生素（同細胞生長液），供細胞維持用。

(14)

磷酸緩衝食鹽溶液：

NaCl	(Merck)	8.0	gm
KCl	(Merck)	0.2	gm
Na₂HPO₄.7H₂O	(Merck)	2.172	gm
KH₂PO₄	(Merck)	0.2	gm
加蒸餾水至		1,000	mL

以121 ℃ 15 lb / cm₂高壓滅菌20分鐘。並以T.S.A. Agar 作無菌檢定。

病材之準備

1.	必須採取發熱期動物之抗凝血，抗凝劑可用肝素、EDTA 或檸檬酸鈉。血球以滅菌之磷酸緩衝液 (PBS) 洗三次，然後懸浮於 PBS 或等張生理食鹽水中，保存於 4 ℃ 供病毒分離用。當血球需較長時間保存而又無法冷藏時，則需保存於 oxalate-phenol-glycerin (OPG) 中。如果可以冷凍的話則以緩衝乳糖蛋白凍液（buffered lactose peptone）保存並儲存於－70 ℃ 以下。本病毒對長期儲存於－20 ℃ 並不安定。

2.	如為流產胎兒，則其脾臟與淋巴結是供病毒分離最好之病材。病材需泡於 PBS 或等張生理食鹽水中並以 4 ℃ 冷藏送往實驗室。

分離病毒

1.	雞胚胎接種分離病毒：
	前述洗好之血球溶於蒸餾水或是以超音波處理，然後取 0.1 mL 接種於 10～12 日齡雞胚胎之血管內。本法施行不易，須加以練習。接種後將蛋放回33.5 ℃ 之孵卵機繼續孵化並每日照蛋。接種後 24 小時內死亡者為非特異性予以丟棄，2 至 7 日死亡者收集之並保存於 4 ℃，第 7 日尚未死亡者也殺之。感染之胚胎通常有出血現象。收集之胚胎去除頭部後磨成乳劑，離心以去除沉渣。含有病毒之上清液，可以抗原陷捕免疫酵素結合試驗或間接螢光染色法加以鑑定或是再接種於培養細胞。於接種之雞胚胎腦中的病毒也可以抗原陷捕ELISA 檢測（實驗室尚未備有此診斷試劑）。如果第一次接種未能引至胚胎死亡需再接種一次。

2.	血球溶解物中之病毒也可以接種於初生小白鼠腦內、 L cells、仔倉鼠腎細胞株 (BHK-21)、非洲綠猴腎細胞（VERO）、或白斑蚊細胞（Aedes albopictus cells）來分離。但是這些方法分離之效果通常較雞胚胎接種來得低。

3.	如果血中病毒含量非常低時，例如感染後數週所採之血液，則利用綿羊接種來鑑定一直是非常有用的方法。接種之清洗血球量為可疑病畜血液 500 mL所清洗下來之量，或是50 mL病材乳劑之上清液。接種之綿羊需飼養 28 天，並以膠內免疫擴散反應或競爭性ELISA 檢測其抗體。

細胞培養分離病毒

1.	要記住很重要的一點是病毒的族群 (population)，不是所有的藍舌病病毒都具有相同的基因與胺基酸序列，以及在感染動物血中出現之病毒，僅有少量甚或微量比例其病毒蛋白具有專屬的胺基酸序列，可以吸附至培養細胞並進行複製。這也許是為何將毒血直接接種於培養細胞不易分離到病毒之原因。要病毒能於培養細胞中大量增殖，最少須通過雞胚胎一或二代。以細胞培養分離 EHD 病毒則較為敏感。

2.	最常用於分離藍舌病病毒之細胞是 BHK-21、VERO、 L cells 和白斑蚊細胞。培養之單層細胞接種 1 mL打碎之血球或 10 % 之病材上清液，置 37 ℃ 5 % CO₂ 恆溫箱中 5 天，觀察有無細胞病變作用（CPE）產生，如無細胞病變作用，需再繼代。白斑蚊細胞則無需觀察細胞病變。欲確認所分離之病毒是藍舌病病毒，可利用抗原陷捕ELISA（實驗室尚未備有此診斷試劑）、免疫螢光、過氧化酵素抗過氧化酵素（peroxidase-antiperoxidase ; PAP）或病毒中和試驗。

免疫學鑑定方法

1.	病毒血清群分類：
	Orbivirus 的分群是基於特定標準抗血清對病毒蛋白例如 VP7 的檢測。藍舌病與 EHD 之交叉反應會使多源抗體之免疫螢光反應，將分離到的 EHD 病毒誤認為藍舌病病毒。此問題可以藍舌病特異單株抗體解決。有些實驗室生產此等特定血清群試劑。通常鑑定血清型別的方法是微量中和試驗。

2.	免疫螢光：
	培養於蓋玻片上之 BHK 或胎牛腎臟細胞，於形成單層細胞後接種由細胞培養增殖或溶解自雞胚胎的病毒，於 37 ℃ 培養 24～48 小時後，或出現中度細胞病變作用時，細胞以 paraformaldehyde、丙酮或甲醇固定，乾燥，以標準藍舌病抗血清進行螢光標示抗體染色步驟。

3.	斑點抑制法（ plaque inhibition ）：
	以 5×104 PFU 之標準病毒及欲鑑定之病毒接種於培養在 90 mm 培養皿的單層細胞上。感作後去除病毒液，以瓊脂覆蓋細胞，再將含個別標準抗血清的濾紙片置於瓊脂上，培養至少 4 天。在含有相對應的抗血清濾紙片周圍的病毒層被中和，因此細胞得以存活。

4.	微量中和試驗：
	96 孔培養盤每孔加入 100 TCID₅₀ 之標準病毒與未鑑定型別之病毒50μL ，然後與等量之已稀釋標準抗血清混合。加入104 個細胞之細胞液 100μL，培養 4～6 天，記錄其細胞病變作用之程度，比較其相似度。僅有抗血清及僅有細胞之孔必須無細胞病變。

血清學抗體試驗

感染動物之藍舌病抗體有數種方法可以檢出。從未感染藍舌病之動物感染藍舌病後均會產生群別及型別特異抗體，重複感染多重型別之藍舌病病毒時則檢測困難。

膠內免疫擴散反應（AGID）：

AGID 用於檢測藍舌病抗體簡單而又有效。因此自 1982 年以後即成為標準檢測方法。與 EHD 交叉反應的問題，可以競爭性 ELISA 解決。

本法是以七孔之打洞器於 2.8 mm 厚之瓊脂盤上打洞，洞之直徑為 4 mm，洞距 2.4 mm，中間一孔四週六孔，抗原置中央孔，四週六孔其中三孔為陽性血清，另外三孔為待檢血清。瓊脂盤置潮濕盒中於 20～25 ℃ 作用 24 小時後判定之。其詳細步驟為：先以蒸餾水配製 0.85 % NaCl（生理食鹽水），再以生理食鹽水配製 0.9 % Agarose（瓊脂，Sigma A-6138），加熱溶解使成透明，冷卻至 45 ℃ 時分裝於平皿，60×15 mm 平皿每個分裝 6 mL或 100 ×15 mm 平皿每個分裝 15 mL或 45×90 mm 平皿每個分裝 11 mL，冷卻後以七孔之打洞器打洞。中央孔加抗原 25μL，四週六孔之檢測血清及對照血清加之量也均為 25μL。置潮濕盒中 24 小時後觀察一次，48 小時再觀察一次。

競爭性 ELISA：

競爭性 ELISA 可免除與其他環狀病毒之交叉反應。其特點為使用單源抗體，主要針對病毒蛋白的 VP7。測試抗體與單源抗體競爭抗原。

(1)	96 孔 ELISA 盤之被覆：
	VP7 抗原以 0.05 M 碳酸緩衝液（pH 9.6）稀釋，立即分裝於 96 孔 ELISA平底盤每孔 50μL，密封後置 4 ℃ 一夜。或 37 ℃ 一小時。（市售成品已事先被覆不須此步驟）。

(2)	清洗：（市售成品不須此步驟）
	將前一日被覆之 96 孔 ELISA 平底盤反轉過來甩掉內容物，須將它甩至容器槽，再以不起毛球之吸水紙瀝乾，並用PBST清洗液（0.01 M PBS 加 0.05 % Tween 20, pH 7.2）將每個 96 小孔注滿後，再將液體甩掉，再瀝乾，共清洗五次。
	注意： 96 孔 ELISA 盤之小孔內不得讓它乾掉。

(3)	加入待測血清：
	血清以含 3 % BSA 之 PBST 稀釋成 10 倍，每孔加 50μL （市售成品以所附稀釋液稀釋被檢血清及對照血清成 10 倍），加入單源抗體50μL，室溫感作1小時。

(4)	市售成品稀釋液配製法為所附濃縮稀釋液15 mL加135 mL之蒸餾水。

(5)	接著把 96 孔 ELISA 盤封蓋起來，置於 37 ℃ 恆溫箱內的搖擺機上，持續搖擺 1 小時，或 25 ℃ 感作 3 小時。
	注意：所用的平板搖擺機，要有效的完全混合，且不得將內容物濺出（搖擺速率每分鐘 120 次）。若沒有平板搖擺機時，可改用手打方式，於盤子四周輕敲打，以使反應物均勻混合。如 96 孔 ELISA 盤在恆溫箱中的搖擺機上需重疊時，它只蓋上最上面的一盤，而此種情形可能造成熱差度效應及蒸氣，最好不要重疊。

(6)	結合體 (conjugate) 的加入：
	在感作終止之前，馬上以稀釋液，將結合體稀釋，量要足夠所用於檢測的 96 孔盤。例如6 mL之稀釋液加50μL之結合體。
	操作方法：
	感作 1 小時後從恆溫箱中取出 96 孔盤，不用清洗。馬上加入50μL之結合體稀釋液至每一孔中，並輕拍盤子四周，確定結合體的稀釋液都完全落於每孔之底部。再將盤子封蓋後置於 37 ℃ 恆溫箱中搖擺 1 小時

(7)	在結合體感作終止之前，須先準備受質溶液，它的量要足夠所檢測的盤數，ABTS 的濃度 1.0 mM， H₂O₂ 是 4.0 mM 溶於 50 mM sodium citrate 中，pH 4.0。最後的受質溶液必須是無色的，且存放於黑暗處，如有色澤呈現，則必須丟棄。（市售成品之受質溶液為ABTS直接可用）。
	一塊乾淨沒有被覆抗體的 96 孔盤，可用來當作光讀機判讀時的背景盤（此盤用完後可清洗，並可用作未來測試時的背景盤用）。

(8)	操作方法：結合體感作一小時後，用前述方法清洗 96 孔盤，要確定所有孔洞均完全被清洗緩衝液沖洗，以清除無反應之結合體。

(9)	清洗完成立即加入受質溶液每孔 100 mL，由空白對照盤開始，於加第一孔時即開始計時，室溫 30 分鐘。

(10)	30分鐘後由空白對照盤開始加停止液，每孔50μL，置搖擺機使混合均勻。

(11)	置ELISA判讀機以405 nm波長判讀其OD值。
	OD陰性血清－ OD受檢血清抑制率％＝ ------------------------------------------------------------------------- × 100 　 OD陰性血清－ OD高力價血清
	抗體陽性則抑制其呈色，抑制率大於40 %為抗體陽性，介於40 % ±5 %則須再觀察及重做。

附錄：各種試劑配製

1.	0.01 M PBS
	取PBS粉末一瓶（Sigma）溶於滅菌過之蒸餾水1000 mL中 pH 7.4 ±0.20 標貼後保存於4 ℃，不可超過二週

2.	0.04 M PBS
	取PBS粉末一瓶（Sigma）溶於滅菌過之蒸餾水250 mL中 pH 7.4 ±0.20 標貼後保存於4 ℃，不可超過二週

3.	0.08M PBS
	取PBS粉末一瓶（Sigma）溶於滅菌過之蒸餾水250 mL中 pH 7.4 ±0.20 標貼後保存於4 ℃，不可超過二週

4.	0.1M NaOH
	取NaOH 0.4 gm 溶於滅菌過之蒸餾水100 mL中以塑膠瓶盛裝標貼後保存於室溫

5.	細胞培養液
	MEM (GIBCO) 900 mL 青黴素 100 IU / mL 鏈黴素 100 mg / mL Fungizone 250 mg mL 標貼後保存於4 ℃，不可超過四週。

6.	清洗液(0.002 M PBS)
	取PBS粉末一瓶（Sigma）溶於滅菌過之蒸餾水5000 mL中 pH 7.4 ±0.20 標貼後保存於室溫，不可超過二週

7.	細胞培養液
	MEM (GIBCO) 900 mL 青黴素 100 IU / mL 鏈黴素 100 mg / mL Fungizone 250 mg mL 標貼後保存於4 ℃，不可超過四週。

8.	清洗液 (0.002 M PBS)
	取PBS粉末一瓶（Sigma）溶於滅菌過之蒸餾水5000 mL中 pH 7.4 ±0.20 標貼後保存於室溫，不可超過二週

9.	停止液（1.25 M sulphuric acid）
	慢慢的將68 mL濃鹽酸 (18 M) 加入932 mL之蒸餾水中標貼後保存於室溫

10.	細胞製備
	將BHK-21或VERO細胞自培養角瓶上，以trypsin消化下來，經沖散後，以細胞培養液泡成每毫升含2 × 105個懸浮細胞，置於4 ℃中備用。

11.	生理食鹽水
	NaCl 8.5 gm溶於1,000 mL蒸餾水。

12.	EDTA
	Versene（EDTA．4Na） 2 gm 蒸餾水 100 mL pH 7.4

◎ 診斷流程圖 ◎

1.	血清學試驗：
	病材：配對血清(paired sera) 方法：AGID測定競爭性ELISA 檢測

2.	病毒分離：
	病材：抗凝血、流產胎兒之脾臟與淋巴結方法：接種於10-12日齡雞胚胎、已形成單層細胞之BHK-21、VERO細胞等株化細胞。

3.	病毒確認：免疫螢光、微量中和試驗

附圖１

附圖２

附圖３

ELISA操作程序