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豬瘟實驗室診斷步驟

內容
豬瘟實驗室診斷步驟

（The Diagnostic Techniques of Hog Cholera）
豬瘟可疑患處畜
↓
採取病豬血液並施行
病理解剖，觀察病變
。並採脾臟、淋巴結、
扁桃腺及其他各臟器。
 
(A)病理組織
　 切片檢查		 (B)冷凍切片
　 豬瘟螢光
　 標示抗體
　 染色檢查
　( 直接法
　與間接法 )		 (C)細胞培養
　 (PK-15
　 或 CPK )
　 接種後
　 48 小時
　行豬瘟螢
　光抗體染
　色法( 直
　接法與間
　接法 ) 或
　接種後行
　間接免疫
　酵素斑點
　染色檢查		 (D)取全血計
　 算白血球
　 數及作血
　 液塗抹片
　 觀察白血
　 球像，並
　 取脫纖血
　 行 PCR
　 檢測病毒
　 ；取血清
　 行 END
　 中和抗體
　 測定
 		 (E)細菌培養


病　材　採　取
(The Collection of Specimems)
僅可能在病理早期採取病材
；若死亡應立刻解剖採材。
採取血液計
算白血球數
，作血液塗
抹片行白血
球像觀察。		 動物解剖以
消毒劑擦拭
體表，戴手
套，以無菌
工具剝離皮
膚。		 液體病材以
無菌針筒抽
取，分裝於
小容器內，
密封。		 刮取病材以
無菌刮匙取
上皮細胞或
黏膜，加入
適當含抗生
素之緩衝液
。		 棉拭病材以
棉棒採取病
材，立即浸
泡於含抗生
素之緩衝液
中。		 糞　　　便
取糞便加入
緩衝液，做
成 20% 混
懸液。
  ↓
病原分離		 ↓
採取病材
 
病原分離以
無菌工具採
取內臟器官
置於無菌容
器內，如果
未能馬上檢
查，冷凍於
-70℃。		 病理檢察切
取適當大小
，浸泡於
10 % 福馬
林液內，(
組織厚度不
超過 3 mm
為宜 )。		 凍結切片採
取內臟器官
，切成 0.5
cm×1.0cm×
0.3 cm大小
。若無法立
即製作切片
，應置金屬
盒內，密封
後外包鋁箔
，於 -70 ℃
凍結保存。
    離 　　　心

4 ℃ 1,950 g
30 分鐘取
上清液，以
緩衝液配成
20 %混懸液
後，再離心
一次。
　　↓
第二次離心
所得之上清
液加入 5 X
抗生素，4
℃放置 1小
時。
　　↓
病原分離
豬 瘟 實 驗 室 診 斷 方 法
 
(一) 豬瘟之細胞培養接種及螢光標示抗體染色檢查步驟

以含 10% 小牛血清及 5 倍抗生素之 MEM，做 10～20％ 之脾臟、淋巴結、扁桃腺等檢體乳劑
↓
取 8 孔細胞培養玻片 (Chamber Slide)，每孔加入 0.2 ml 檢體乳劑與 0.2ml 之 PK-15 細胞懸浮液 (含 4 × 105 個細胞 / ml )
↓
經 37℃ 培養 48 小時後，甩棄培養液，除去塑膠盤壁，以吹風器吹乾。
↓
經甲醇固定 2 分鐘，再除去甲酵，以 PBS 清洗。
↓
加入豬瘟螢光標示抗體 (0.1 ml / 孔 )並於 37℃ 染色 30 分鐘。
↓
以 PBS 洗 3 次，除去孔間樹脂帶，再滴 50% Glycerin-PBS 混合液一滴，覆蓋玻片。
↓
螢光顯微鏡下判讀豬瘟特異螢光。
陽性者有細胞質內之綠色均質化的特異螢光，陰性無螢光出現。
  (二) 豬瘟中和抗體 END 檢測法準備工作
(The Preparation for Exaltation of Newcasle Disease virus；END Method)
(A) 細胞：
　　初代豬睪丸細胞 (Primary Swine Testicle Cells；ST)：以無菌操作技術取下 4～6 週齡健康小豬睪丸，經去莢膜、剪碎，並以 0.0l M PBS，PH7.2 和 0.25％ 胰蛋白酶液各洗過一次後之組織碎塊，再以 0.25％ 胰蛋白液於細胞消化瓶內在磁力攪拌器上，室溫攪拌消化 10～15 分鐘。細胞消化液，先經 15O mesh 濾網過濾後加入 1/10 倍量之 56℃，30 分非動化處理小牛血清，並置 4℃ 冰箱中。剩餘之組織塊，再重複予以消化，直至全部被消化掉為止。最後，將收集得之細胞濾液經 4℃，1,000 rpm 離心 5 分鐘。沉澱細胞再以含 10％ 胎牛血清 ( 無 BVD 抗體 )、抗生素 (Penicillin G Sulfate 100 U/ml 和 Streptomycin 100 μg/ml) 和抗霉素 (Fungizone 250 μg/ ml) 之 MEM 細胞培養液 ( Minimum Esential Medium，Eagle Base) 泡製成約 4.0×1O6 Cells/ml 的豬睪丸細胞懸浮液。供豬瘟病毒力價和豬瘟中和抗體 END 法測定用。
註： 0.25％ 胰蛋白酶液配製法
秤取胰蛋白酶粉末 30gm(Gibco，1：250)，溶於 3,000 ml之0.0l M，PBS，PH 7.2 溶液內。再經 0.45 和 0.2μm 過濾膜過濾，並分裝於滅菌血清瓶內，置 -20℃ 冷凍保存，即為 1％ 胰蛋白酶原液。使用時，先經解凍後再以 0.0l M，PBS，PH 7.2 泡製成 0.25％ 胰蛋白酶 (1％ 胰蛋白酶原液：PBS＝1：3)
(B) 病毒：
1. 新城雞瘟病毒 (NDV)：宮寺株新城雞瘟病毒係以雞胚胎尿囊腔內接種增殖。10～11 日齡雞胚胎蛋，在照蛋燈光透視下，選擇接近氣室邊緣，避開血管處，拭以碘酊消毒，打洞，再拭以碘釘。以 26 gauge 5/8 inch 長之針頭，採腔與蛋平行方向插入約 1/2 inch，並將病材 0.2 ml 注入尿囊腔內。蛋孔以臘密封，置孵卵器內進行病毒增殖。每日照蛋收集斃死胚蛋 ( 接種後 24 小時內死亡之胚蛋丟棄不收集 )，收取尿囊液。經 4℃，3,000 rpm 離心 30 分鐘後，小量 (1 ml) 分裝於試管內並置 -70℃ 冰凍保存，同時測定其血球凝集力價。
＊＊血球凝集反應 (Hemagglutination ；HA)
　　先以注射針筒抽取 4 ml Alsver 液 ( 葡萄糖 2.05％；枸櫞酸鈉 0.80％；食鹽 0.42％，枸櫞酸 0.055％)，然後由雞之翼靜脈採血 4 ml。加入 5 倍量之 PBS，PH 7.2 溶液 ( 或 0.85％ 生理食鹽液 )，以 2～3 層紗布過濾後，1,500 rpm 離心 10 分。棄上清液，沉澱血球以 PBS，PH 7.2 溶液 ( 或 0.85％ 生理食鹽液 ) 作成懸浮液，再離心，如此重覆洗 3 次。最後之沉澱血球，則以 PBS，PH 7.2 溶液 ( 或 0.85％ 生理食鹽液 ) 作成 0.5％ 血球懸浮液，供新城雞瘟病毒血球凝集反應用。其操作步驟如下：
(1)

在血球凝集板第一行第 1 孔加入０.9 ml PBS，PH 7.2 溶液 ( 或 0.85％ 生理食鹽液 )。其餘第 2 至第 10 孔每孔分別加入 0.4 ml，供病毒液稀釋用。 另在第二行任意一孔亦加入 0.4 ml 作為對照。
(2) 在第 1 孔加入 0.1 ml 新城雞瘟病毒液使成 10 倍稀釋。充份混合後以吸管吸取 0.6 ml 並移 0.4 ml 至第 2 孔使成 20 倍稀釋，同時丟棄剩餘的 0.2 ml。第 2 孔混合液經充份混合後，以吸管吸取 0.4 ml 並移至第 3 孔使成 40 倍稀釋。如此重覆操作並行至第 10 孔，經充份混合後丟棄 0.4 ml。如此做成 10 倍至 5,120 倍間之 2 倍連續稀釋。
(3) 在血球凝集板各孔分別加入 0.4 ml 之 0.5％ 雞紅血球懸浮液。
(4) 血球凝集板經充份震盪後置於室溫 1 小時後判定結果，並登記病毒之血球凝集價。
 
血球凝集反應術式
  
註：一單位 (HA) 為 640X
2. 豬瘟病毒 (HCV)：A76 株豬瘟病毒係由日本分讓而得。本試驗使用時再經豬初代睪丸細胞培養增殖，小量 (1 ml) 分裝於試管內並置 -70℃ 冰凍保存，同時測定其組織感染力價 (TCID50)。
＊＊以細胞培養法測定豬瘟病毒力價：
(1) 將 A76 株豬瘟病毒液以細胞生長液 (Growth Medium) 由 l0-1 至 l0-6 作 10 倍連續稀釋。於 96 孔塑膠細胞培養盤第 1 和第 2 列每孔放入 10-1 稀釋倍數病毒液 0.025 ml，第 3 列每孔放入 10-2 稀釋倍數病毒液 0.025 ml。以此類推，直至第 7 列每孔放入 10-6 稀釋倍數病毒液 0.025 ml 為止。其餘第 8 列至第 12 列每孔則放入細胞生長液 0.025 ml。
(2) 上述 96 孔微量塑膠培養盤，每孔再加入 0.1 ml 之初代豬睪丸細胞液 (4×105 個細胞)，然後放置 37℃，5％CO2 孵卵器內培養 4 天。
(3) 經吸去培養液後，第 1 列以及第 11 列和第 12 列每孔加入細胞生長液 0.1 ml 作為豬瘟病毒感染細胞和正常細胞之對照。而於其第 2 列至第 10 列每孔加入 0.l ml 的宮寺株新城雞瘟病毒液 (1 HA 單位 ) 攻擊，其中第 8 列至第 10 列為新城雞瘟病毒液感染對照。再放置 37℃，5％CO2 孵卵器內培養 3 日。
(4) 每天觀察細胞情形並以第 3 天為最終判讀。TClD50 之計算係依 Reed-Muench Method 法計算之。


 
＊僅高於 50% 之感染率百分率　＊＊僅低於 50% 之感染百分率
由以上公式求得之 0.6 加到僅高於 50% 感染率的稀釋指數 ( 此例中為 10-3) 得
10-3 即該病毒之感染力價為 10-3.6 TCID 50 / 0.025ml。
 
  (三) 豬瘟中和抗體END檢測法的操作方法
  豬瘟中和抗體試驗 (END method) 步驟
1. 中和試驗係以 96 孔微量塑膠培養盤進行試驗，以 0.025 ml 細胞生長液作為稀釋液並加等量血清進行 2 倍連續稀釋。
2. 稀釋後之血清再加入等量的 A76 豬瘟病毒液 (100 TCID50)，培養盤在震盪器上充份震燙後放置於 37℃5％CO2 孵卵器內感作 1 小時。
3. 感作後每孔再加入 0.1 ml 之初代豬睪丸細胞液 (4×105 個細胞 )，然後放置在 37℃5％CO2 孵卵器內培養 4 天。
4. 經吸去培養液後，每孔加入 0.1 ml 的宮寺株新城雞瘟病毒液 (l HA 單位 ) 攻擊。再放置 37℃5％CO2 孵卵器內培養。
5. 試驗中同時設立豬瘟陽性和陰性血清、豬瘟病毒、豬瘟與新城雞瘟病毒、新城雞瘟病毒以及正常細胞等對照組。標準陽性血清與預測血清的處理方法同。
6. 每天觀察細胞情形並以第 3 天為最終判讀。
7. 判讀時，若量太多而不便使用顯微鏡觀察，則可用 0.5％ 結晶紫甲醇溶液固定染色十分鐘，以自來水沖洗乾淨後觀察之。
註：

0.5％ 結晶紫甲醇溶液配法如下：
結晶紫 (Crystal Violet)　0.5 克
70％ 甲醇 (Methanol)　100 ml
完全溶解後即可使用。

 

註： 1. 每一稀釋倍數採用 2 孔培養盤
2. 判定時＋：表示有 CPE，即無豬瘟抗體價；－：表示無 CPE，即有豬瘟抗體價。
3. P.S= 豬瘟陽性標準血清；N.S：豬瘟陰性標準血清。
  (四) 豬瘟之PCR診斷方法
(A)

RNA 的製備步驟：
　　取 100 微升 (ul) 的病毒血液置於 1.5 ml 微量管 (Microtube) 中，加 0.6 毫升 GTC Buffer，以研磨棒研磨，再加入 70 微升的 3M 醋酸鈉 (Sodum Acetate)，0.6 毫升水飽和酚 (Phenol) 及 0.2 毫升的 CI 溶液，完全混合後，震盪 l0 秒鐘，隨即冰浴 15 分鐘，再經 4℃，10000g 離心 20 分鐘，將水層轉置於另一支經 DEPC 處理過之微量管中，加入等量異丙醇 (Isopropanol) 放入 －20℃ 冰櫃，冷凍 1 小時，再以上述條件離心，倒去上層液，再加入 60％ 酒精以 4℃，10000g 離心 15 分鐘後，抽去上層液，經抽氣乾燥，加入經 DEPC 處理過之水再溶解，即以完成核酸之製備。
(B) cDNA 的製備方法：
　　將萃取的豬瘟病毒 RNA，加入 2.4 單位的鳥類骨髓母細胞症病毒 (Avian Myeloblastosis Virus；AMV) 之反轉錄酶及 16 單位的 RNA 酶抑制劑 (RN-asin)，0.01 Nanomole 的 HCVl 引動子，在 2.5 倍 Taq 緩衝溶液中，於 42℃ 進行反轉錄作用 30～60 分鐘，即完成 cDNA 的製備。
(C) PCR 反應條件：
　　將反轉錄作用後所得之 cDNA 產物，在 95℃ 處理幾分鐘，把反轉錄酶不活化後直接加入 0.0l Nanomole 的 HCV2 引動子，及 2.0 單位的 Taq DNA 聚合酶，並補充 0.02 Nanomole 的核甘三磷酸，最後加蒸餾水至 l00 微升之總反應體積。反應條件為 94℃ 變性 30 秒，45℃ 煉合 1 分鐘，72℃ 延展 1 分鐘，共 30 個循環數。
(D) PCR 產物電泳分析：
1. 洋菜凝膠片 (Agarose Gel) 製作
　　用 TAE 緩衝液泡製 2％ 洋菜凝膠片，方法是取 2 克的洋菜凝膠粉末，加入 98 ml 的 TAE 緩衝液加熱使 Agarose 溶解，待降溫至 50℃ 時，再加入 50 微克 (μg) 的溴化醯液 (Ethidium Bromide)，充分混合後，倒入製膠台，待冷卻凝固後，即可供跑電泳。
2. PCR 產物之載入、電泳及判讀
　　取 10 微升 (ul) 的 PCR 產物，與 1 微升 (ul) 的載入緩衝液 (Loading Buffer)，充份混合後，以微量吸管注入洋菜凝膠中，再以 100 Volts 電壓，電泳分析 30 分鐘，經 UV 燈照射檢視，當有 300bp 長的 BAND 產生，而陰性對照組不產生時，即為豬瘟陽性反應；若均沒有 BAND 產生則為豬瘟陰性反應。
(E) 化學藥品及溶液之配方：
1. GTC 緩衝液：
4M Guanidinium Thiocyanate
25 mM Sodium Citrate, pH 7.0
0.5％ Sarcosyl
O.1 M B-mercaptoethanol
2. CI 溶液：Chloroform (24) + Isoamylalcohol (l)
3. 電泳 TAE(Tris-Acetate EDTA) 緩衝液：
先泡成 50 倍的濃縮保存溶液，使用時再稀釋成 1 倍溶液。50 倍濃縮溶液之組成如下：( 每公升含 )
　242g Tris Base
　57.1 ml Glacial Acetic Acid
　200 ml 0.5M EDTA (PH8.0)
4. 載入膠片緩衝液 (Gel-Loading Buffer)：
　0.25％ BPB (Bromophenol Blue)
　+ 40％ (W/V) Sucrose in Distilled Water
　儲存於 4℃ 冰箱冷藏。


豬生殖與呼吸綜合症

豬生殖及呼吸症候群診斷技術

The Diagnostic Technique of PRRS

  (一) 豬肺臟巨噬細胞之製備
(The Preparation of Porcine Palmonary Macrophage)
一、 肺臟之採取
　　選取 2～6 週齡健康 SPF 小豬，麻醉 ( 或電昏 ) 後剖腹，切斷後大動脈放血後解剖，以無菌止血鉗夾住咽喉頭處氣管，小心取下心肺，置無菌操作盤備用。
二、 肺巨噬細胞之收集
1. 以無菌止血鉗夾住下端氣管，剪去其上之氣管，插入無菌注射筒 ( 或漏斗 )。
2. 以 150 ml 細胞培養液＊灌入肺臟，輕輕按摩後，自氣管倒出，以離心管收集之。反覆灌洗 6 至 8 次。
＊細胞培養液指含有 10％ 胎牛血清及一般量之 5 倍抗生素與制黴劑之 MEM。
3. 收集細胞沖洗液，以雙層細濾網過濾。
4. 將所得之細胞濾液離心收集 (4℃、280g、13 分鐘 )。
5. 棄上清液。以 10 ml 細胞培養液＊沖散沉澱。收集所得之細胞懸浮液，離心 (4℃、280g、13 分鐘 )。反覆沖洗 3 次。
6. 以 10 ml 細胞生長液＊懸浮最後一次離心所得之沉澱。
7. 取 0.l ml 細胞生長懸浮液以 PBS 適當稀釋混和後，加入等量之 Trypan Blue 水溶液＊＊，混合均勻。
＊＊Trypan Blue 水溶液：
　1.60g Trypan Blue 粉末＋100 ml 生理鹽水泡製備用。
8. 吸取適量混和液，滴入細胞計數盤，計算大而光亮之細胞顆粒 ( 藍色顆粒為死細胞 )。所得每 lmm2 之平均細胞數以下式計算之，即得細胞總數。
巨噬細胞總數 =lmm2 之平均細胞數 × 計算室和蓋玻片之間隔逆數 × 稀釋倍數。
例如稀釋 20 倍後，1mm2 中有 40 個細胞，則：
巨噬細胞總數 ＝ 40 × 10 × 20 = 8,000 ( 個 / mm3)= 8.0 × 106 ( 個 / ml)。
9. 視培養目的，下表稀釋分裝之。

培養容器

細胞數

99 孔培養盤

1.8 × 105 個／孔

25cm2 小角瓶

l2 × l06 個／瓶

75cm2 小角瓶

35 × l06 個／瓶

175cm2 小角瓶

82 × l06 個／瓶
10. 分裝後置 37℃ ，5％ CO2 恆溫箱內培養備用。
三、 冷凍保存
1. 以含 10％DMSO 及 20％ 胎牛血清之 MEM 將細胞稀釋成 1.5×l07 個／ml 後分裝於安瓶內。
2. 先將安瓶置 4℃ 2 小時冷卻，而後於 -70℃ 冷凍庫一夜再移入液態氮桶內保存。
 
(二) ELISA 診斷法
(Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay)
一、 抗原盤之製備：
1. 取無菌平底 96 孔細胞培養盤，第 1、3、5、7、9、11行加入經 PBS 適當稀釋之病毒液(Ag＋) (0.l ml/ 孔 )，而第 2、4、6、8、10、12 行則加入等倍稀釋之巨噬細胞液 (Ag－)。
2. 覆蓋膠膜，於 37℃ 恆溫箱中感作 1 小時後，置 4℃ 冷藏一夜備用。
二、 血清稀釋：
1. 稀釋液：含 10％ 胎牛血清及 2％ Casein 的 PBS 溶液。
2. 於試管內將血清稀釋 100 倍備用。
三、 試驗步驟：
1. 去除膠膜，甩棄抗原液，以含 0.1％ Tween 20 之 PBS(PBS-T) 浸洗 3 次＃後甩乾。
＃每次浸泡 5 分鐘。
2. 每孔加入 0.1 ml 血清稀釋液＃＃，置 37℃ 恆溫器感作 1 小時。
＃＃每頭兩孔 (Ag＋ 與 Ag －各一孔)，而對照孔 B3、B4、B9 及 Bl0 加入已知陽性血清，C3、C4、C9 及 Cl0 加入已知陰性血清。
 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

                        

B

    

＋

＋

        

＋

＋

    

C

    

－

－

        

－

－

    

D

                        

：

：

：

：

：

：

：

：

：

：

：

：

：
3. 甩棄血清稀釋液，以 PBS-T 浸洗 3 次＃後甩乾。
4. 將適當稀釋之山羊抗豬 IgG 結合酵素 (Goat-Anti-Swine IgG Peroxidase Conjugate)0.1 ml 加入，於 37℃ 恆溫器內感作 30 分鐘。
5. 甩棄酵素，以 PBS-T 浸洗 3 次＃，甩乾。
6. 每孔加入 0.1 ml 受質＃＃＃，置 37℃ 搖擺器上作用 15 分鐘後，加入 0.05 ml 硫酸 (1N)，作用 5 分鐘後以光度比色機測定 OD 值。
＃＃＃受質之泡製：
OPD(O-Phenylendiamine Dihydrochloride)

l0.0 mg
醋酸緩衝液 @

22.0 ml
9％ 雙氧水 (H2O2)

0.022 ml
於不透明玻璃瓶中混和均勻後備用。
@ 醋酸緩衝液：
  取 0.58g 醋酸鈉 (Sodium Acetate Anhydrous-CH3COONa) 加 200 ml 蒸餾水，完全溶解後，再以 lN 醋酸 (Acetic Acid-CH3COOH) 調整酸鹼度至 pH＝5。4℃ 保存備用。
☆本受質為致癌劑，請小心操作。　　　　　　　　　　　　　
7. 判讀：
計算下列各值：
　(1)P=1 / 2 OD ( B3－B4＋B9－B10 )
　(2)E=OD (Ag＋) － OD (Ag－)
　(3)S / N= OD (Ag＋) / OD (Ag－)
　　當 E / P > 0.4
　　　 S / N > 1.5
　　判定為陽性。　　 　
  (三) IPMA 診斷法
(lmmuno-Peroxidase Monolayer Assay)
(A) 病毒分離：
1. 取無菌平底 96 孔細胞培養盤，每孔加入 0.1 ml 豬肺臟巨噬細胞液 (2×106 個細胞／ml)，於 37℃ 5％ CO2 恆溫器中培養 2 小時。
2. 每孔加入 0.05 ml 以細胞生長液＆行 10 倍稀釋之血清 ( 未經非慟化 ) 或乳劑，覆蓋膠膜，置 37℃ 5％CO2，恆溫器中培養 2～5 天。
&細胞生長液：
　　含 10％ 胎牛血清、200 U/ ml Penicilline、0.2 mg/ ml Streptomycine 及 80 U/ ml Polymyxine B 之 MEM。
3. 當 10～20％ 細胞發生細胞變性 (CPE) 時取出，以含 0.1％ Tween 20 之 PBS(PBS-T) 快洗 1 次，浸洗 1 次＆＆後甩乾，置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。若培養 5 天後仍無細胞變性發生，需繼代 3 次以確診。
＆＆每次浸泡 5 分鐘。
4. 完全乾燥後，每孔加入 0.1 ml 4％ 福馬林液，於 4℃ 固定 15 分鐘 ( 或於 －20℃ 以 80％丙酮固定 45 分鐘 )
5. 甩棄固定液，以 PBS-T 快洗 1 次，浸洗 2 次＆＆後甩乾，置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。
6. 每孔加入 0.05 ml 適當稀釋之標準陽性血清，進行 B 之試驗步驟。
(B) 抗體測定：
1. 抗原盤之製備：
(1) 取無菌平底 96 孔細胞培養盤，每孔加入 0.1 ml 豬肺臟巨噬細胞液 ( 內含 2×106 個細胞／ml)，於 37℃ 5％ CO2 恆溫器中培養 2 小時。
(2) 每孔加入 0.05 ml 以細胞生長液稀釋，含 1.5×103 TCID50/ ml 之病毒液，置 37℃ 5％CO2 恆溫器中培養 20～24 小時。
(3) 當 10～20％ 細胞發生細胞變性 (CPE) 時取出，以含 0.l％ Tween 20之PBS(PBS-T) 浸洗 2 次＆＆後甩乾，置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。
(4) 完全乾燥後，每孔加入 0.1 ml 4％ 福馬林液，於 4℃ 固定 15 分鐘。
(5) 甩棄固定液，以 PBS-T 浸洗 2 次＆＆後甩乾，置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥後密封，貯存於 -2O℃ 冰庫備用。
2. 血清稀釋：
(1) 稀釋液：含 10％ 胎牛血清及 2％ Casein 的 PBS 溶液。
(2) 於試管內將血清稀釋 50 倍 ( 當作血清原液 ) 後，取出 0.1ml 加入等量稀釋液行 2 倍速續稀釋 。
3. 試驗步驟：
(1) 待抗原盤回溫後開封，以 PBS-T 浸洗 2 次&&後甩乾。
(2) 每孔加入 0.05ml 稀釋液，置 37℃ 恆溫器內 30 分鐘使飽和。
(3) 以 PBS-T 浸洗 2 次＆＆後甩乾，加入 0.05ml 血清稀釋液，於 37℃ 感作 45 分鐘。
(4) 甩棄血清稀釋液，以 PBS-T 浸洗 4 次＆＆後甩乾。
(5) 加入適當稀釋的山羊抗豬 IgG 結合酵素 (Goat-Anti-Swine IgG Peroxidase Conjugate) 0.05 ml ，於 37℃ 感作 45 分鐘。
(6) 甩棄酵素液，以 PBS-T 浸洗 4 次＆＆，甩乾。
(7) 每孔加入 0.05ml 受質＆＆＆，於 37℃ 作用 15～20 分鐘。
  ＆＆＆受質之泡製：
3 Amino-9-Ethy1 Carbazol 2.0 mg
N, N Dimethylformamide 0.3 ml
醋酸緩衝液 @ 5.0 ml
9 % 雙氧水 (H2O2) 0.01 ml
於不透明玻璃中混和均勻後備用。
@醋酸緩衝液：
取 0.58g 醋酸鈉 (Sodium Acetate Anhydrous-CH3COONa) 加 200 ml 蒸餾水，完全溶解後，再以 1N 醋酸 (Acetic Acid-CH3COOH) 調整酸鹼度至 pH=5。 4 ℃ 保存備用。
☆本劑為致癌劑，請戴手套於抽氣裝置下小心操作。
(8) 甩棄未作用之受質以 PBS-T 浸洗 2 次＆＆。每孔加入 0.1 ml PBS-T，於光學顯微鏡下判讀。細胞內有紅色受質者為抗體陽性。
 
(四) IFA 診斷法
(Indirect Immunofluorescence Assay)
(A) 病毒分離：
1. 取無菌平底 96 孔細胞培養盤，每孔加入 0.1 ml 豬肺臟巨噬細胞液 (2×106 個細胞／ml)，於 37℃ 5％ CO2 恆溫器中培養 2 小時。
2. 每孔加入 0.05 ml 以細胞生長液＄行 10 倍稀釋之血清 ( 未經非慟化 ) 或乳劑，覆蓋膠膜，置 37℃ 5％ CO2 恆溫器中培養 2～5 天。
＄細胞生長液：
　　含 10％ 胎牛血清、200 U/ ml Penicilline、0.2 mg/ml Streptomycine 及 80 U/ ml Polymyxine B 之 MEM。
3. 當 10～20％ 細胞發生細胞變性 (CPE) 時取出，以含 0.1％ Tween 20 之 PBS(PBS-T) 快洗 1 次，浸洗 1 次＄＄後甩乾，置 37℃ 暖房 1.5小 時乾燥。若培養 5 天後仍無細胞變性發生，需繼代 3 次以確診。
＄＄每次浸泡 5 分鐘。
4. 完全乾燥後，每孔加入 0.1 ml 4％ 福馬林液，於 4℃ 固定 15 分鐘 ( 或於 －20℃ 以 80％ 丙酮固定 45 分鐘 )
5. 甩棄固定液，以 PBS-T 快洗 1 次，浸洗 2 次＄＄後甩乾，置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。
6. 每孔加入 0.05 ml 適當稀釋之標準陽性血清，進行 B 之試驗步驟。
(B) 抗體測定：
1. 抗原盤之製備：
(1) 取無菌平底 96 孔細胞培養盤，每孔加入 0.1 ml 豬肺臟巨噬細胞液 ( 內含 2×106 個細胞／ml)，於 37℃ 5％ CO2 恆溫器中培養 2 小時。
(2) 每孔加入 0.05 ml 以細胞生長液稀釋，含 1.5×103 TCID50/ ml 之病毒液，置 37℃ 5％CO2 恆溫器中培養 20～24 小時。
(3) 當 10～20％ 細胞發生細胞變性 (CPE) 時取出，以含 0.l％ Tween 20 之 PBS(PBS-T) 浸洗 2 次＄＄後甩乾，置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥。
(4) 完全乾燥後，每孔加入 0.1 ml 4％ 福馬林液，於 4℃ 固定 15 分鐘。
(5) 甩棄固定液，以 PBS-T 浸洗 2 次＄＄後甩乾，置 37℃ 暖房 1.5 小時乾燥後密封，貯存於 -2O℃ 冰庫備用。
2. 血清稀釋：
(1) 稀釋液：含 10％ 胎牛血清及 2％ Casein 的 PBS 溶液。
(2) 於試管內將血清稀釋 50 倍 ( 當作血清原液 ) 後，取出 0.1 ml 加入等量稀釋液行 2 倍速續稀釋。
3. 試驗步驟：
(1) 待抗原盤回溫後開封，以 PBS-T 浸洗 2 次＄＄後甩乾。
(2) 每孔加入 0.05 ml 稀釋液，置 37℃ 恆溫器內 30 分鐘使飽和。
(3) 以 PBS-T 浸洗 2 次＄＄後甩乾，加入 0.05 ml 血清稀釋液，於 37℃ 感作 45 分鐘。
(4) 甩棄血清稀釋液，以 PBS-T 浸洗 4 次＄＄後甩乾。
(5) 關燈，加入適當稀釋的山羊抗豬 IgG 螢光標示抗體＄＄＄ 0.1 ml，於 37℃ 感作 45 分鐘。
＄＄＄含 1％ Evans Blue 之 Fluorescein(FITC)－Conjugated Goat Anti-Swine IgG(H+L)
(6) 關燈下甩棄抗體液，以 PBS-T 快洗 1 次。
(7) 每孔加入 0.1 ml PBS，於螢光顯微鏡下判讀。細胞內有綠色螢光者為抗體陽性。