牛海綿狀腦病之實驗室診斷技術
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一、簡介
牛海綿狀腦病 (bovine spongiform encephalopathy, BSE)，俗稱狂牛病 (mad cow disease)，是一種引起牛致死性的傳染性神經退行性疾病。1985年4月在英國首次觀察到牛有特殊的臨床症狀，於1986年診斷出病原，其病原不是傳統的細菌或病毒等，但卻有感染力，稱之為變性普里昂蛋白質 (scrapie prion protein, PrPsc)。
目前認為PrPsc會將神經細胞內正常的PrPc轉化成PrPsc，而以等比級數的速度累積在神經細胞內，而造成神經細胞死亡，終使腦組織變成海綿樣，所以是一種造成動物致死性神經變性的疾病，統稱為傳播性海綿狀腦病 (transmissible spongiform encephalopathies, TSE) 或普里昂疾病 (prion diseases)，在人引起庫賈氏症 (Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD)、kuru症、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群 (GSS) 及致死性家族性失眠症 (fatal familial insomnia, FFI) 等，在牛引起BSE，在羊引起搔癢症 (scrapie)，在貂引起傳染性貂腦病 (transmissible mink encephalopathy, TME)，在鹿與麋鹿引起慢性消耗病 (chronic wasting disease, CWD)，在貓、獅、豹引起貓科海綿狀腦病 (feline spongiform encephalopathy, FSE)，許多動物皆有類似的疾病，在受感染宿主會形成腦組織的海綿狀變性與神經膠細胞增生等病變。疾病之致病機序各有所不同，目前的研究顯示BSE的爆發可能是牛飼料添加之肉骨粉中含有大量的羊搔癢症病原所致。
此外，近年的研究顯示發現導致BSE的病原與發生在人類的變異型庫賈氏症 (variant CJD) 有關，所以將BSE的病原假定為會染給人類。自從英國爆發BSE之後，至2001年止許多國家包括：奧地利、比利時、捷克、丹麥、芬蘭、法國、德國、希臘、愛爾蘭、義大利、日本、列支敦斯登、盧森保、荷蘭、波蘭、葡萄牙、斯洛伐克、斯拉維尼亞、西班牙、瑞士等國也陸續有病例發生，尤其是2001年日本有三個確診病例，表示本病已由歐洲地區擴散至亞洲地區，所幸國內迄今未有病例報告。
因此為了防範BSE入侵我國，確保國民健康及畜牧產業之永續發展，亟需建立國內BSE診斷技術及診斷實驗室，故筆者等於2001年7月28日至8月11日赴美國「國家普里昂疾病病理診斷中心」，2001年11月18日至23日接受國際畜疫會之邀請赴泰國參加「區域性牛海綿狀腦病診斷與監測研習會」，研習BSE相關診斷技術，目前已符合國際畜疫會訂定之診斷標準，建立本病之實驗室生物安全、組織病理學診斷、免疫組織化學染色法、西方免疫墨點法及酵素連結免疫吸附分析法等診斷流程並持續進行本病之監控計畫。
二、現行診斷方法
BSE的診斷以組織病理學為主，並至少應配合免疫組織化學染色法或西方免疫墨點法或酵素連結免疫吸附分析法等其中一種檢驗方能進行確診，茲將已建立之實驗室診斷方法詳述如後：
(一) 組織病理學診斷法
將採集的牛腦組織置於10 % 中性福馬林液固定完全後，取大腦、小腦及腦幹共十個部位的腦組織，其重點部位為延腦 (medulla oblongata) 成"V"字形尖端的閂 (obex)，修整為約4mm的厚度，放入脫水包埋盒中，再浸泡於98%的蟻酸中1小時 (將具感染能力的prion不活化)，然後再浸泡於10%中性福馬林液中2天。再依一般例行之病理切片方法，將組織塊脫水、石蠟浸潤、石蠟包埋等步驟，製作成3-5 m厚之切片，脫蠟後以H&E染色及封片，於顯微鏡下觀察各部位腦組織切片中的病理變化。經H&E染色之組織切片於顯微鏡下進行判讀，感染BSE牛隻在神經病理學上主要呈三個特殊病變為：1. 腦皮質灰質部產生空洞狀退化。2. 神經元細胞壞死及數目減少。3. 神經星狀膠質細胞增多 (astrocytosis)，使腦組織呈現海綿樣變性 (spongiform change)。若發現上述病變者，則判定為陽性，但仍需進行下列方法以進行確診。
(二) 免疫組織化學染色法 (immunohistochemistry, IHC)
利用對prion蛋白質特異性的單株抗體及免疫染色技術來達到偵測牛腦組織中的PrPsc 為目的。其組織切片製作方法與組織病理學診斷之步驟相同，每次染色需同時染陽性對照切片。組織切片如常規進行脫蠟後，以磷酸鹽緩衝液 (0.1M phosphate buffer solution, pH7.2, PBS) 洗3次，置於蛋白K溶液中37℃15分鐘。將切片放入不銹鋼盒中加入沸水，置於1bar 121℃高溫高壓滅菌器中20分鐘後，再以PBS洗3次，然後置於3%雙氧水溶液中10分鐘，再以PBS洗3次。取出切片，組織周圍以無塵拭紙吸乾水分，置於保溼盤中，在組織上滴滿5%的正常豬血清，於室溫20分鐘，倒掉血清，在組織上滴滿PrP單株抗體 (F99/97.6.1, VMRD Inc.)，置於37℃4小時或隔夜，再以PBS洗3次，在組織上滴滿次級抗體 (biotinylated secondary antibody, DAKO ChemMate detection kits)，於室溫10分鐘，以PBS洗3次，在組織上滴滿受質 (peroxidase conjugated streptavidin, DAKO ChemMate detection kits)，置於室溫10分鐘，以PBS洗3次，再用蒸餾水洗去鹽類，在組織上滴滿呈色劑 (AEC or DAB substrate, DAKO ChemMate detection kits)，於室溫5分鐘，用蒸餾水洗。滴上蘇木精複染數秒，然後水洗，滴上封片膠，蓋上蓋玻片，置於顯微鏡下鏡檢。
(三) 西方免疫墨點法 (Western immunoblot method)
採用商品化檢測套組 (PrionicsR-Check, Roche Applied Science)，其原理主要是偵測腦組織中對蛋白K有抵抗性的PrPsc，因為正常的prion蛋白質會被蛋白K所消化，而不正常的PrPsc對蛋白K具有抗性，只會被部分消化，所以分子量會由32-35kD變為27-30 kD。選取延腦的閂 (obex) 或腦幹或大腦灰質部的腦組織，秤重後加入均質液研磨成10倍均質乳劑，取100 l乳劑加10 l 消化緩衝液及10 l 蛋白K混合均勻後置於50℃加熱40分鐘，然後加10 l消化停止液以終止反應。再加入100 l PAGE樣本緩衝液混合均勻，加熱至96℃ 5分鐘。架設電泳膠片，加入電泳緩衝液於電泳槽內。將待測樣本及對照樣本各加10 l於電泳膠片孔內以200伏特電泳30-45分鐘。電泳膠片取出以濕式轉漬器來進行轉漬 (transfer) 至PVDF膜上，於4℃ 150伏特 1小時。然後取出膜加入以Ponceau S染色2分鐘，標示標記分子的大小，然後以 TBST (Tris-Buffered-Saline with Tween) 脫色。以PVDF阻斷緩衝液於室溫震盪0.5-1小時，以1:5000倍稀釋的單株抗體，置於震盪器上於室溫反應1-2小時，然後以TBST洗4次，再以1: 5000倍稀釋的次級抗體，置於震盪器上於室溫反應0.5-1小時，以TBST洗4次。將膜浸泡於 Luminescence 緩衝液中震盪5分鐘，然後加入50 l CDP-Star於室溫5分鐘，然後將膜上的水分吸乾，置於透明保護膜內於暗房中放入X光底片上壓片，再沖洗底片觀察結果。
(四) 酵素連結免疫吸附分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
採用商品化檢測套組 (BSE purification kit & PLATELIAR BSE detection kit, Bio-Rad)，此目前最快速且敏感的檢測方法，乳劑之製備方法同前，取500 l乳劑加500 l蛋白K溶液 (1 ml denaturing solution＋4 l proteinase K) 混合均勻，置於37℃ 10分鐘，再加500 l clarifying solution，混合均勻後離心20000g 5分鐘，倒掉離心管中的液體，並倒立於吸水紙上5分鐘，然後各加50 l resolving buffer，置於100℃加熱5分鐘，混合均勻後加入250 l sample diluent。取出檢測盤，於孔內分別加入100 l陽性對照、陰性對照及待測樣品，用膠片封盤，置於37℃感作75分鐘。以washing solution清洗三次，拍乾後加100 l conjugate，再用膠片封盤，置於4℃感作60分鐘，以washing solution清洗五次，拍乾後加100 l revelation solution，置於室溫下之暗室30分鐘，加100 l stopping solution，以450/620 nm 波長ELISA reader讀取結果。
三、其他診斷方法
目前BSE的診斷除了前述的四種方法外，陸續可能還有許多更新的檢驗技術與檢驗套組會不斷地被開發出來，但目前大多仍處於研究階段未能普遍地被應用於診斷。例如在檢驗技術方面，有些實驗室應用基因轉殖鼠 (transgenic mice) 來進行人工動物接種試驗，大幅縮短原先接種小白鼠所需的292天潛伏期，但因實驗動物的飼養較費人力，且需在符合生物安全三級的陰壓動物舍飼養，所以目前仍只應用於研究領域。
另外在腦脊髓液的檢驗方面，由BSE的確診病例發現，藉由雙向電泳分析法 (two dimensional gel electrophoresis) 可偵測出指標性蛋白質apolipoprotein E，但目前尚無法應用於臨床診斷，因為這種蛋白質不具特異性，只可作為神經退行性變化的非特異性指標。同樣地，從腦脊髓液中偵測14-3-3蛋白質的方法，或是藉由腦脊髓液與血清偵測S-100蛋白質也因特異性低，同樣不適用於BSE的診斷。
至於活體檢驗部分，目前只有利用免疫組織化學染色法應用於羊搔癢症之扁桃腺與眼瞬膜進行活體檢驗，但是根據實驗接種牛的結果發現，不僅在潛伏期，甚至在臨床發病期都無法從淋巴組織偵測到具有感染力的prion，故不能應用於BSE的診斷，所以目前仍有許多學者正在積極地研發其他活體生前的檢驗方法。
亦有學者藉由電子化學分析法 (electrochemical analysis) 偵測感染prion動物尿液中的代謝物，但是這種方法的敏感性和特異性較低，目前仍不建議用作單一的診斷法。
在檢驗套組方面，目前除了前述商品化的免疫西方墨點法與酵素連結性免疫吸附法檢驗套組之外，目前較新的檢驗套組同樣是利用ELISA的原理，只是改用冷光 (chemiluminescence) 來呈色以提高其敏感性與特異性。雖然新的檢驗技術不斷地推陳出新，但是由於許多新的檢驗方法缺乏真實之黃金診斷標準 (true gold standard)，而且因為隨著潛伏期的不同對前述檢驗方法的敏感性也有所不同，若是要應用在診斷仍需再評估。根據國際畜疫會的建議，若是在發生率低的地區或是非疫區的監控仍是以組織病理學診斷與免疫組織化學染色為主。