錦鯉疱疹病毒症鑑定標準操作程序
- 內容
目 的
錦鯉疱疹病毒症鑑定標準操作程序中所制定之內容係提供農業部獸醫研究所實驗室中處理及進行錦鯉疱疹病毒症實驗室診斷操作時所必須之程序，以確保檢驗水準之一致。
名詞定義：
1. 錦鯉疱疹病毒症
錦鯉疱疹病毒症（Koi herpesvirus disease）是一種只會引起錦鯉及鯉魚嚴重死亡的傳染病。本病首發於以色列（1998年），現今美國、德國、英國、比利時、印尼均有發生傳出。對各種年齡之魚隻均可感染，接觸後7-10天開始發病，外觀並無任何特異病變，僅鰓部有潮紅、腫脹，偶見白斑及出血，死亡率可達80-100﹪。
2.錦鯉疱疹病毒
錦鯉疱疹病毒（Koi herpesvirus）是一個具二十面體，大小為110-113nm，具有封套的雙股DNA病毒，現今歸於疱疹病毒科（Herpesviridae）。。設施及材料：
1. 實驗室：符合國家安全標準的Ⅱ級實驗室。 2. 低速離心機：最高速5,000 rpm，具低溫控制（KUBOTA-5910，Japan）。 3. 微量離心機：最高速14,000 rpm（興泰，台灣），具有1.5 mL微量離心管插槽轉子。 4. 剪刀：端頂為尖型，13.5 cm長（台灣製）。 5. 迷你震盪器：最高2,500 rpm（IKA-ms1，Germany）。 6. 乾式恆溫器：最高150℃，具有20孔插槽（VBS，台灣）。 7. 程式控溫儀：Rapidcycler（Idaho，USA）。 8. 迷你電泳槽：Mupid（Advance，Japan）。 9. 瓊脂鑄膠模：台灣製。 10. 研缽及杵：台灣製。 11. UV燈箱：台灣製。 12. 玻璃砂：台灣製。 13. 磷酸緩衝液（PBS）：取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4˙7H2O 2.172 g及KH2PO4 0.2 g加入1,000 mL蒸餾水中，121℃，15 lb/cm2，15分鐘滅菌。（以上為Merck產品）。 14. Tris-acetate（TAE）：先泡50, TAE，泡法如下：取242 g Tris base、57.1 mL冰醋酸及100 mL 0.5 M EDTA，然後加水至1,000 mL，121℃，15 lb/cm2，15分鐘滅菌。（以上為Merck產品） 15. 0.5 M EDTA（pH 8.0）：取186.1 g EDTA-2Na˙2H2O加至800 mL蒸餾水中，以攪拌子攪拌，緩衝加入NaOH至pH 8.0（約20 g的NaOH顆粒），121℃，15 lb/cm2，15分鐘滅菌。 16. dNTPs（10 mM）：內含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10 mM（Biotools，Spain）。 17. Taq（5U/μL）：Bioline，England。 18. 10 x NH4 Reaction Buffer：Bioline，Enaland，不含MgCl2。 19. 50 mM MgCl2：Bioline，England。 20. 瓊脂（Agarose）：Invitrogen，USA。 21. 電擊器：自製。 22. QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，USA）。 23. 15 mL離心管：PP材質，無菌包裝（Greiner，Germany）。 24. 微量離心管：PP材質（Labcon，USA），使用前滅菌。 25. 跑膠緩衝液（6x buffer）：含0.25﹪bromophenol blue、0.25 xylene cyanol FF、30﹪甘油。 26. 溴化乙醯（ethidium bromide）：購買10 mg/mL之成品（Sigma，USA），欲使用前以水稀釋成0.5 mg/mL，本物致癌須小心使用。 病材採集及處理：
將活檢體以電擊器之夾子夾住嘴及尾部，以家用交流電通電2分鐘後，然後以70%的酒精消毒鰓蓋，剪去鰓蓋，選取最外一片鰓弓，以剪刀剪5枝重約1公克的鰓絲，置入滅菌研缽，以剪刀剪碎至長約1 mm小大的片段，加入1公克滅菌玻璃砂，以杵研磨至乳糜狀，再加入9 mL的無菌PBS，混合均勻，移入15 mL塑膠離心管，4℃，1,500 rpm (430 x g)下離心15分。DNA之萃取 (採用QIAamp DNA Mini Kit之方法)
1. 取100 μL上述離心之上清液，加入100μL ATL buffer，混合於1.5 mL的微量離心管。 2. 加入20 μL的蛋白?K (Proteinase K)，震盪混合，置於56℃乾式恆溫槽至完全溶解(此時內容物呈透明清澈)。感作時每15分鐘震盪乙次，約45分即可完成。 3. 以8,000 rpm (6,000 x g)，離心10秒，將管內之水蒸氣凝成之水滴離心下來。 4. 加入200 μL AL buffer，1,400 rpm，震盪15秒，置於70℃感作10分。再依步驟3離心一次。 5. 加入200 μL 100% 酒精，1,400 rpm，震盪15秒。重覆步驟3離心一次。 6. 將上述混合液置入QIAamp 離心管內 (QIAamp spin column)，然後再將此管放入2 mL的收集管內。8,000 rpm (6,000 x g) 離心1分。丟棄有廢液的收集管，將QIAamp離心管移至另一新的收集管上。 7. 打開QIAamp離心管蓋，加入500 μL AW1 buffer，蓋上蓋子，以8,000 rpm (6,000 x g) 離心1分。丟棄有廢液的收集管，將QIAamp離心管移至另一新的收集管上。 8. 打開QIAamp離心管蓋，加入500 μL AW2 buffer。蓋上蓋子，以14,000 rpm (20,000 x g) 離心3分。將廢液收集管倒掉，放回離心管，再離心1分，條件如前。 9. 將QIAamp離心管放入一新的1.5 mL 微量離心管，並丟棄原先含廢液的收集管。打開離心管蓋加入200 μL AE buffer，室溫感作1分，然後8,000 rpm (6,000 x g) 下離1分。將此洗出DNA存於 -20℃備用。 聚合酶鏈反應檢測
1. 取dNTP (10 mM) 2 μL，10 x buffer 5 μL，MgCl2 (50 mM) 2μL，引子KHV 9/5 F (5'─GACGACGCCGGAGACCTTGTG─3')及引子 KHV 9/5 R(5'─CACAAGTTCAGTCTGTTCCTCAAC─3')濃度為10 μM，各3 μL，dH2O 24.8 μL，Taq (5U/μL) 0.2 μL，最後加入10 μl之DNA，最終反應液體積為50μL。陽性對照為加入1μL含特異片段的質體，陰性對照則為加入dH2O取代DNA。 2. 先在95℃下加熱5分。然後進行39次循環的增幅 (每次包括94℃，1分；68℃，1分；72℃，30秒)。最後進行72℃，7分的延長。 電泳分析
1. 取1.2克瓊脂加入100 mL 1x TAE 緩衝液，配成1.2%瓊脂溶液，以微波爐加熱至透明清澈狀態。 2. 待冷至55℃時，倒入迷你鑄膠模內，插上鑄膠梳，待其凝固後，拔梳以保鮮膜包背，存於4℃。 3. 分析PCR產物時，取10 μL 上述PCR產物混合2μL 6x跑膠緩衝液，逐一加入瓊脂膠片槽內。另外添加100 bp 核酸標準5 μL至另一槽內。 4. 電泳液為1x TAE緩衝液，電泳方向為由負極至正極，電泳時間為100 V下20分。 5. 泳動後在含0.5 μg/mL溴化乙醯之水中30鐘，脫色5分然後在254波長之UV燈箱觀察，PCR產物會呈現484 bp大小的螢光片段。陽性對照應呈現相同大小片段，陰性對照不呈現，此時可初步判定為?疹病毒感染陽性。將此產物送經定序並將結果與基因庫已有序列比對，則可進一步確定與該外國分離株的親緣關係。 附註： 1. 本病毒的DNA易因重複冷凍解凍而分解，因此建議萃取完之DNA應該分成多個小管冷凍在 -80℃，解凍使用後即不再使用。 參考文獻
Gilad O, Yun S, Andrce KB, Adkison MA, Zlotkin A, Bercorier H, Eldan A, Hedrik RP (2000) Initial characteristics of koi herpesrvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Dis Aquat Org 48:101-108