Ｑ熱
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摘 要
Q型熱（Q fever）是發生在大部份國家的人畜共通傳染病（zoonosis），人感染後會成為本病的保毒者（reservoirs）。Q型熱是由立克氏體（rickettsia）稱為伯納特氏柯克斯氏體（Coxiella bunetii，簡稱伯氏柯氏體）所引起的傳染性疾病，大小約0.3μm x 1μm的。可以Stamp's 法來染色，它以兩種型態出現：第一類病原性，分離自動物或人得到，和第二類低病原性，經由蛋多次繼代後得到的。伯氏柯氏體祗能生長在雞胚胎或是細胞培養中。
人感染Q型熱時，會呈急性型（肺炎、肝炎、感冒症狀、頭痛）或是嚴重慢性型（心內膜炎），它可能是緊跟著不容易被發現的早期感染而來。急性型可以在用適當的抗生素治療後立刻得到改善，但慢性型則需要更長時間的抗生素治療（達二年以上）並且要隨時做血清學檢查來監控。有疫苗可供實驗室人員或是公共屠宰場的工作人員使用。
動物感染時，無明顯的臨床症狀但會有流產、胎盤滯留、子宮內膜炎、不孕症和死產等現象。小型反芻類動物感染常會呈現急性的型態，並且在畜群裡會突然發生流產，然後沒有任何其它症狀之下自然痊癒。經常在數年之後，會再復發。最近在加拿大和歐洲發現貓也會感染同樣的疾病，它可能會發生在分娩時或是有流產的現象。
實驗室人員在處理伯氏柯氏體必須要注意它對人的感染性，所以在處理時要特別地小心。實驗室感染是經常發生的。
病原菌的鑑別：實驗室診斷可以由胎盤、陰道分泌物、流產胚胎的胃內容物如果需要的話，還可以從乳液和初乳（雖然這些液體中的抗原量不穩定而且數量很少）來採取樣本。
立克氏體可以用油鏡來檢查，胎盤抹片用2%的鹼性品紅(basic fuchsin)染色再以甲基藍(methylene blue)做對比染色後，可以看到紅染的菌體。經由這檢查再配合血清學和臨床症狀的檢查，即可有足夠的證據來診斷此疾病。另外，也可以用雞胚胎來培養。
如果懷疑感染本病或是要做更深入的檢查時，可以用接種實驗動物的方法(天竺鼠、小白鼠、倉鼠)。如果設備較好的實驗室裡，也可以做聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)的試驗。
血清學試驗：有許多血清學的試驗方法可供應用，最好的方法是補體結合(CF)試驗、間接螢光抗體(IFA)試驗和酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)。需要的疫苗和診斷用生物製劑：可以用感染本病原菌的卵黃囊(yolk sacs)再接種到雞胚胎所得到的不活化疫苗來接種。疫苗可以製備成水溶性的懸浮液，也可以加上佐劑(adjuvant；氫氧化鋁或是礦物油乳化劑)。疫苗每年最好補強注射。疫苗也可以和其它的抗原混合，特別是和披衣菌(chlamydia)抗原混合，如此可以提供多價的疫苗使用在羊、山羊和牛做預防接種之用。
疫苗可能會有局部性的不良反應，特別是嚴重感染的牛常會有此現象。用接種疫苗的兔子以補體結合試驗的方法來檢查疫苗的效力。反芻獸接種疫苗之後，所產生的補體結合抗體非常不穩定。可以製備較不起不良反應的疫苗，但它們的成本會很高。
A.診 斷 技 術
Q型熱是發生在大部份國家的傳染性疾病，它是由立克氏體稱為伯納特氏柯克斯氏體(Coxiella bunetii，簡稱伯氏柯氏體)所引起。菌株之間的差異性很大。伯氏柯氏體可以引起人和各種品種動物的熱性疾病。對人來說，它會引起類似感冒的症狀、肺炎、肝炎和心內膜炎(14)。它也會引起乳牛、綿羊和山羊的流產和產科學上的障礙。
大部份國家都有此疾病的血清學資料。它在許多國家感染許多不同品種的動物，但不一定出現臨床上的症狀。另外，如果分離到此病原也並不表示就會出現此疾病的症狀。在羊或牛群裡不一定會發生流產，立克氏體可以從正常分娩動物的胎盤中取得（雖然情形很少）。感染的動物可能會意外地從乳汁中找到病原菌，但數量可能很少。扁蝨(tick)可能和傳播本疾病有關，但它主要是經由呼吸道來傳播，經由吸入污染Q型熱病原的灰塵而感染，因為流產動物的胎盤中存有大量的病原。
很重要的是，伯氏柯氏體對人有致病性，經常發生實驗室感染的例子。所以在處理這微生物時要非常地小心(看第1.5章)。
1. 病原菌的鑑別
在流產後，立刻從胚胎、胎盤和陰道分泌物中採集樣本。也可以取自乳液或是初乳。伯氏柯氏體視樣本的不同和診斷目的之不同，可以用各種方法來診斷。
由懷疑是立克氏體感染之流產動物的胎盤組織所製成的玻璃抹片來檢查。以下的方法是快速染色法(Stamp染色法)，用2%的鹼性品紅溶液染色後，立刻用3%的醋酸(acetic acid)溶液脫色，再以甲基藍或孔雀綠(malachite green)溶液做對比染色。染色好的抹片在顯微鏡底下(x 500)檢查。可以在藍或綠色的背景下，看到數目很多的細小、粉紅色的桿菌體。由於它的菌體很小（長0.3 ~ 1.5μm x 寬0.25μm），因此有時候會很難判別，但是由於它的數目很多，它會呈藍或綠色的背景下呈現一團紅色的菌體來提供判別上的幫助。在顯微鏡下，柯氏體和披衣菌以及布氏桿菌都很類似，但在這染色下披衣菌的輪廓比較明顯，外形比較圓、小，很類似球狀，而布氏桿菌則比較大（長0.6 ~ 1.5μm，寬為0.5 ~ 0.7μm），它的形狀更明顯而且染色更深。例行的診斷上，用顯微鏡檢查配合血清學的檢查已足夠確診出本疾病。已知的柯氏體、披衣菌和布氏桿菌的陽性染色抹片可以幫助作為顯微鏡檢查的參考。
做特殊的實驗室調查時，可能需要做病原菌的分離培養(5)。如果在顯微鏡底下看到很多的伯氏柯氏體，但祗有很少的其它細菌的污染時，可以直接將樣本接種於雞胚胎。接種的樣本是來自胎盤，將一部份胎盤在含有青黴素和鏈黴素的磷酸緩衝溶液(PBS)內加以均質化，然後再低速離心，取其上清液加以稀釋。用此稀釋液接種到5日齡雞胚胎的卵黃囊裡，將接種後 5 日內死亡的雞胚胎捨棄不用。在接種後第10 ~ 15天收集卵黃囊。將卵黃囊壁染色做顯微鏡檢查，以證實本菌的感染。如果要得到純培的話，還要做更多次的繼代。用顯微鏡直接檢查菌體的存在，已足夠作為診斷的基礎。
如果是污染很嚴重的樣本，例如胎盤，或是祗有少量的菌體存在，例如乳汁中時，則需要做動物接種。最適合接種的動物是小白鼠和天竺鼠，因為天竺鼠的感受性比小白鼠還大 10 倍，所以最適合使用。在做腹腔注射之後，檢查體溫和抗體產生的情形。如果有發熱的情形時，將它殺死取其脾臟接種到雞胚胎裡。這方法必須配合同時將樣本注入天竺鼠後，再做血清學檢查。接種後 21 天採集血清，如果得到陽性結果，則可以證實是伯氏柯氏體感染。
免疫螢光反應也可以配合胎盤抹片的檢查，但因為會有外因性螢光之干擾，所以在判讀上非常困難。
最近用聚合酶鏈反應(PCR)的技術可以檢查出小量的病原之存在，但它需要在有適合設備的實驗室之下操作。
2. 血清學試驗
有許多血清學的方法可以使用，但是最常被使用的方法是：間接螢光抗體(IFA)試驗、酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)和補體結合(CF)試驗。使用何種方法，則視國家的不同、實驗室現有的設備和操作人員的技術等而定。
(a) 補體結合試驗
這是由Kolmer所發展出的冷固定微量法(cold fixation micromethod)，它使用96-孔U型底的微量滴定盤。它可以檢測出血清中的抗體（例如，接種後的兔子或是在流產後做流行性的診斷調查）。補體結合試驗使用的歷史較久但較目前應用的試驗不敏感，它仍被許多國家的實驗室使用中（例如法國）。
它的操作分成兩個步驟。將抗原和補體結合的抗體以及羊紅血球置於一起，再和相關的免疫血清作用。抗原/抗體複合物無法和補體結合而使紅血球會和補體結合而導致溶血。
˙反應劑
用pH7.2的佛羅那-鈣-鎂緩衝溶液(VB)。
溶血系統：用VB配成2%的羊紅血球懸浮液和用VB稀釋成特定力價的溶血性抗-紅血球羊血清以等量混合。 補體：市售冷凍乾燥補體或新鮮天竺鼠血清。 抗原：使用製造商提供固定力價的商用抗原。另外，可以用下列方法來配製。在生理鹽水中將感染的卵黃囊磨碎，加入乙基汞化水楊酸鈉(thiomersal)稀釋成1/5，和等量的乙醚混合，再讓乙醚自然蒸發，並重覆這個步驟。用高速離心將沉渣洗淨，重覆做一次這步驟。再配成懸浮液，以100℃水浴，再以超音波處理。用特異性抗血清來滴定抗原。
（注意：每個不同的抗原所得到的血清學結果有很大的不同，而且有很多不同菌株的抗原〔綿羊、牛、人〕或來自本土的菌株）。 陽性和陰性對照血清。
˙預先滴定
(1)將血清不活化，用佛羅那緩衝液稀釋成1/10，在58.5℃下放置30分鐘。同時也將已知的陰性和陽性對照血清不活化。
(2)在微量滴定盤內滴定溶血性血清：加入 25μl 已知的溶血濃度(1/30)的補體，25μl的溶血性血清 + 2%羊紅血球(加倍稀釋溶血性血清)。包括不含補體的血清。設定好稀釋濃度使其等於2溶血單位(haemolytic units)。
(3)在微量滴定盤內滴定補體：用佛羅那緩衝溶液將補體或是天竺鼠血清稀釋成1/30或是1/60。使小孔中含有25μl的溶液再加入25μl的溶血性抗血清。設定好稀釋濃度，使其等於2溶血單位。
(4)在微量滴定盤內滴定抗原：將抗原(水平的方向)和已知力價的陽性血清(垂直的方向)在滴定盤上做梯度稀釋。並使最高稀釋濃度的抗原力價能和最高稀釋濃度的血清產生反應。確定不同稀釋濃度的抗原沒有抗補體的反應。
(5)將25μl各種不同稀釋濃度的抗原放入各別的小孔內和25μl不同稀釋濃度的血清以及25μl的補體。
(6)蓋上滴定盤，用玻璃膠帶封住，放入4℃的冰箱中18小時。
(7)加入25μl 的溶血性抗血清並在37℃下培養30分鐘。
(8)在4℃下用低速離心(500 xg)後判讀結果。
˙結果的判讀
力價在1/10和1/40之間顯示有潛伏性的感染。由一群5到10隻動物所得到的血清樣本有一個以上血清力價在1/80以上的情形時，則判定為有進行性的感染。
(b) 間接螢光抗體試驗這試驗有中等程度的敏感度。實驗室裡必須有免疫螢光顯微鏡和必備的反應試劑。這試驗目前使用的國家有加拿大、德國和其它一些國家。為了要排除非特異性螢光的干擾，所以抗原必須經過數次的分層離心將之高度純化。可以使用商用的補體結合抗原。也可以買到用於診斷人類Q型熱的簡易使用包裝（例如巴黎，巴斯德研究所的 "Ricketsilam C. burnetii"）。它可以用牛抗-免疫球蛋白來取代人抗免疫球蛋白螢光軛合物。
將兩倍梯度稀釋的待測血清放在事先已用特異性抗原被覆小孔的免疫螢光玻片上。假如有特異性抗體存在的話，它會在玻片上形成一複合物。最後加上和異硫氰酸鹽螢光素(fluorescein isothiocyanate)軛合的牛免疫球蛋白之抗體後於螢光顯微鏡底下檢查。
˙所需材料和試劑 螢光顯微鏡。
保持溼度的恒溫箱、洗淨盆和支持抗原用的玻片。最後一項可以由供應商購買或是在實驗室裡製備(每塊玻片有12個直徑7毫米的孔，並用抗原被覆後保存在4℃或 -20℃之下。 將濃縮的螢光抗免疫球蛋白軛合物用磷酸緩衝液按照廠商的指示稀釋。 磷酸緩衝溶液、緩衝甘油溶液、1%伊凡氏藍(Evans blue)染色溶液。
˙試驗步驟
(1)被測血清以56℃的溫度30分鐘不活化，然後稀釋成1/20到1/2,560的濃度。(2)取出被覆著抗原的玻片置於室溫。不能觸碰及小孔之表面。(3)將不同稀釋濃度的血清(10 ~ 30μl)加入到小孔內。加入陰性和陽性對照血清。其中一孔加入一滴磷酸鹽緩衝溶液作為抗原的對照。(4)放置在37℃有溼度的恆溫箱內30分鐘。用磷酸鹽緩衝溶液將玻片洗兩次，每次10分鐘。再用清水清洗後讓其自然風乾。(5)將經過伊凡氏藍染色液稀釋的特異性(牛)抗免疫球蛋白螢光軛合物加入包括對照組的小孔內。置於37℃有溼度的恆溫箱內30分鐘。用蒸餾水洗淨後讓其自然風乾。加幾滴緩衝性甘油之後，蓋上蓋玻片。用放大 40倍以上的螢光顯微鏡底下檢查。
˙結果的判讀
如果看到黑色的背景裡有光亮的小點時，即為陽性。陰性反應則沒有這些光亮的小點。
軛合物也可以由其螢光來證實，陰性對照血清應會有陰性的結果。非特異性螢光經常會呈不規則形狀的點。
稀釋濃度在1/20或1/40時，可以看到明顯的螢光反應，則判定為陽性。在急性的感染期或是流產之後，可以得到1/160 ~ 1/320以上的值。
(c) 酵素結合免疫吸附試驗這是相當敏感的試驗。在有此設備(分光比色計)和反應試劑的實驗室裡，也很容易操作。它漸漸地取代了前面兩種所述的試驗方法。它需要相當純化的抗原，用做補體結合試驗的抗原可以在此作為被覆試驗盤之用。假如無法買到特異性的抗球蛋白軛合過氧化氫酵素的高度免疫血清時，可以用競爭性ELISA試驗來取代。現在市場上可以買到立刻可使用的套組。
微量試驗盤裡的小孔用不活化抗原處理。假若樣本裡含有特異性抗體時會和盤裡的抗原結合。這軛合物會被固定在抗原 - 抗體的複合物上。
將過多的軛合物洗除。加入呈色劑(chromogen)，呈色劑是經過氧化氫酵素氧化而呈出具有顏色的化合物。用分光比色計加上過濾鏡片(405或490 nm)後，測其吸光度。
˙所需材料和試劑
˙試驗步驟˙結果的判讀廠商已提供判讀和它所測出值的解釋。計算以下血清的平均吸光度(Ab)：被測試血清之平均吸光度(Abx)、陽性對照血清的平均吸光度(Abpos)、陰性對照血清的平均吸光度(Abneg)。判讀方法如下：
Ab < 30% 陰性血清
Ab 30 ~ 40% 存疑之血清
Ab > 40% 陽性血清假如實驗室是使用自已配製的抗原、陽性和陰性對照血清的話，則必須重新計算。
(d) 目前已不常用之試驗方法 曾經被使用過的Giroud微凝集反應技術已被以上所述的試驗所取代。它的方法是將一滴含伯氏柯氏體置於玻片上再加一滴待測的稀釋血清。根據血清學上的研究，稀釋成1/20的血清已足夠被測試出來。將玻片置於37℃有溼度的恆溫箱內12個小時。取出待其乾燥之後，再以Giemsa染色。最後置於顯微鏡底下，觀察結成塊的菌體。另外一種毛細管凝集試驗是將抗原置於毛細管內，然後再入血清來做檢查。18小時之後，如果是陽性反應的話，可以看到凝集反應的發生。有一種過敏試驗也曾被用來做診斷，用不活化、純化的菌體接種到皮膚或是眼瞼。這個試驗可以作為流行病學的調查試驗，但現在已不常使用。B. 需要的疫苗和診斷用生物製劑Q型熱的疫苗是由培養在雞胚胎的卵黃囊裡的伯氏柯氏體菌株加以不活化所製備而成。最好是用無特定病原(SPF)的雞蛋來取代一般的雞蛋(因為會從飼料添加物中殘留下抗生素)。這病原菌可以很容易加以不活化。疫苗是以懸浮液的方式或是加上佐劑(Adjuvant)。最有效的方法是用礦物油(油/水乳化)加以乳化的疫苗。用為疫苗的菌株必須小必地篩選，因為最近用限制性酶 (核酸內切酶 [endonucleases])和血清學研究顯示，許多伯氏柯氏體抗原會獨立產生異源性的抗原變異株。最好的方法是由當地取得的疫苗菌株來做全國統一使用的標準菌株。血清學的調查顯示，綿羊和山羊血清和Henzerling 菌株可以產生最好的反應，但牛血清則和Nine Mile菌株可以產生最好的反應。假如沒有當地的菌株可以使用的話，可以用這兩種菌株來製備疫苗。一般來說，疫苗的效果都很不錯，但是如果想從乳汁中完全去除這病菌的排出時，則非常困難。曾經在羊和山羊發生過疫苗失敗的例子。疫苗是在動物未懷孕或懷孕早期時使用。在充滿感染機會的環境下，最好是每年都做疫苗的接種。如果乳牛的乳汁中常發現有伯氏柯氏體存在時，最好的疫苗使用方法是在一年中接種二至三次。它已有用於人類的疫苗，經過很大量的試驗結果證實有非常好的效果。1. 種菌的管理
(a) 種菌的特性一般都是用Nine Mile菌株(ATCC VR 146)來作為製造疫苗的標準菌株。它是第二類源於牛的菌株，比最近分離出來的第一類感染實驗室人員的菌株有較低的毒性。作為小型反芻類動物的疫苗，可以用當地或是綿羊菌株。源於人的Henzerling菌株(ATCC VR 145)可能最早是源於綿羊的感染，在沒有國家或國際上的綿羊菌株可以使用之情況下，可以用此菌株取代。
(b) 培養方法用無特定病原的雞胚胎來培養伯氏柯氏體，可以使其變成第二類病菌。反過來說，如果在動物體內繼代時，可以再重建它的毒力而使其再恢復到第一類菌株。種菌株的貯備可以用冷凍乾燥的方法或是放入玻璃瓶貯存於 -80℃之下或是用液態氮來貯存。
(c) 合格的疫苗 疫苗以皮下注射羊或山羊肩膀後或牛頸部或垂肉。疫苗可以減低但無法阻止分娩後病原菌的排出。接種於感染的乳牛可以明顯地減少子宮內膜炎、不孕症和虛弱仔牛發生的病例(12，17，19)。最好的治療方法是做完預防接種的同時再做抗生素的治療(19)。
2. 製造方法
一般都是用無特定病原的雞胚胎來生產疫苗。將病原注入5 ~ 6日齡雞胚胎的卵黃囊裡，在第12 ~ 15天待雞胚胎死亡後收集病原菌。感染雞胚胎的卵黃囊會呈現稻草黃的顏色特徵，而未感染的卵黃囊則呈橘黃色並且有較一致的粘稠度。於第5到第10天之間死亡的雞胚胎將之捨棄不用。作為雞胚胎接種的是有毒力的菌株，它是用磷酸鹽緩衝溶液將卵黃囊均質化後稀釋成1/100，並加入青黴素(500國際單位/毫升)和鏈黴素(0.5毫克/毫升)。將收集的樣本置於密封的均質器(homogeniser, Sorvall型) 加入3份的PBS加以均質化。懸浮液在37℃下用1.6%的甲醛24小時使之不活化。將它貯存於4℃之下，並做安全性、不活化和無菌的測試。捨棄上層含有脂質的上清液。再將這懸浮液在中等速度下離心30分鐘，將上清液丟棄後再加入PBS重覆離心。最後離心所得的懸浮液用PBS稀釋成可以提供每個蛋有20疫苗劑量或每個蛋有20毫升的接種量，如果是用油質乳劑疫苗則用2毫升的劑量。加入乙基汞化水楊酸鈉(thiomersal)當作保存劑，並稀釋成最終濃度為1/10,000。Q型熱疫苗可以直接使用或是和其它的抗原混合使用，例如披衣菌疫苗，它可以用來預防乳牛、牝羊和山羊爆發流產和一些產科的併發症。Q型熱的疫苗也可以製備成油性，它含一份的不活化病原菌懸浮液和一份油質乳劑(例如Montanide 82R或是Marcol 82R和一拒水性乳化劑)。
3. 過程中的控制
卵黃囊內必需含有多量的伯氏柯氏體並且不能有其它雜菌的污染，它用磷酸鹽緩衝溶液配成之懸浮液必須做Stamp's法的染色抹片來加以確定。
4. 分批控制
(a) 滅菌和菌體的確認 可以參考第1.4章來做無菌和無生物物質污染的試驗。用油性顯微鏡來觀察Stamp's法染色之玻璃抹片，可看到數目很多、非常均質化的細小短桿菌。用此方法足夠可確認此病菌。
(b) 安全性 用10個5日齡的雞胚胎於卵黃囊內接種取自均質並經不活化的卵囊病原。接種後的胚胎不能死亡，並在一週後做檢查。卵黃囊內不能出現病原菌或是有感染伯氏柯氏體的顏色變化。然後再做第二次雞胚胎接種，此時不能造成雞胚胎任何異常。另外，用最後生產的兩倍疫苗劑量接種兩隻有感受性的動物，再做觀察。
(c) 力價均質的卵黃囊懸浮液接種雞胚胎的方法很難用來作為力價的測定，因為胚胎的死亡率不會和稀釋的濃度成比例。但如果用無特定病原的雞胚胎來測定力價，則比較容易。用顯微鏡的方法可約略算出菌量的多寡。不用接種動物的方法來做疫苗的測定，因為它的操作非常困難而且很容易因此而感染操作人員。也不用血清學的方法來檢查接種疫苗動物，因為在反芻動物的補體結合抗體出現的量很不穩定。疫苗的效力可以用實驗動物做測定，測定它的免疫動力學和補體結合抗體的力價。兔子可以對疫苗產生很好的反應。用2毫升的疫苗接種5或10隻兔子，在接種前和接種後3週採集血液。它的補體結合抗體力價比較之下，必須約增加1/20 ~ 1/80。
(d) 免疫的有效時間
被覆Q型熱抗原的96-孔微量滴定盤、分光比色計、有可丟棄尖端的微量滴定吸管、陽性和陰性對照血清、用過氧化氫酵素標定的反芻類抗-免疫球蛋白血清、10倍濃度的濃縮稀釋液(PBS Tween)、兩次蒸餾的蒸餾水、呈色劑(OPD[對苯二胺]，ABTS[2,2'- 連氮基-雙-(3-乙基苯二氫塞唑-6-磺酸)])、過氧化氫。
(1)用9份的蒸餾水加1份的濃縮稀釋液配成之稀釋溶液待用。
(2)取出被覆Q型熱抗原和呈色劑溶液的微量滴定盤置於室溫下。
(3)將被測試血清稀釋成1/100。取0.1毫升的稀釋血清置於小孔中待測，對照血清也分別放入另一孔中。
(4)將滴定盤蓋住，並使之置於室溫下90分鐘，或是密封後於2 ~ 8℃ 冰箱內放置隔夜。倒出液體後洗三次。
(5)依照廠商的說明，將軛合物稀釋後每一孔置0.1毫升。最好事先按照廠商的建議，稀釋濃度附近做成不同的稀釋濃度來測試這軛合物。將蓋子蓋好，讓其在室溫下靜置90分鐘。倒出液體後洗三次。
(6)加入0.1毫升經過氧化氫適當稀釋的呈色劑。例如：OPD(0.1毫克/毫升)溶於0.1M 的醋酸、0.2 M pH4.8 的 Na2HPO4 和 30% 的過氧化氫溶液(0.2μl/毫升)或是0.25 mM ABTS溶於pH5.0的檸檬酸磷酸鹽緩衝液(citrate phosphate buffer)和30%的過氧化氫溶液(0.1μl/毫升)。(7)搖動滴定盤。 用分光比色計來判讀（視所選擇的呈色劑在405或490 nm的波長）。如果需要的話，加入3M的硫酸使反應中止。
疫苗接種計畫為人工授精或配種之前15天對未懷孕的動物做一次皮下注射。嚴重感染的情況時，接種一個月之後再補強一次。
有子宮內膜炎的乳牛，疫苗則作為緊急的治療方式來接種，並且每年做一次免疫之補強。
(e) 穩定性
作為立即使用的液體不活化疫苗可以維持有效的抗原性，並且可以在2 ~ 6℃下保存兩年之久。
(f) 保存劑甲醛不活化疫苗可以加入濃度為1/10,000的乙基汞化水楊酸鈉當做保存劑。
(g) 注意事項（可能的危險）
疫苗接種時，最重要的是注意器具的消毒。為了避免產生嚴重的局部反應，疫苗應注入皮下或是肉垂中。這種反應常發生在牛的接種時，它的起因是油性的佐劑或是懸浮液受到污染的緣故(15)。
從未接種的小牝牛第一次做疫苗接種可以得到最好的結果。
在疫苗純化之後，可以用氯仿-甲醇來處理以減低它的副作用，但是可能會減低它的抗原性和增加疫苗的成本(11，18)。
5. 成品的測試
(a) 安全性
從每一批產品裡挑出一瓶來做無菌測試。因為在做貯備疫苗時已經做過安全的測試，所以在這裡可以不必重覆做。
(b) 力價